凝胶过滤层析(分子筛)纯化蛋白

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凝胶过滤层析(分子筛)定义

  凝胶过滤层析,又称凝胶渗透层析、分子筛层析等,层析也称为色谱,凝胶过滤层析即根据样品中分子的大小进行分离的液相色谱法。凝胶过滤层析法中,常用的固定相有琼脂糖、聚丙烯酰胺和惰性葡聚糖凝胶等,其中葡聚糖凝胶应用最为广泛,凝胶颗粒本身不带表面电荷具有很多孔隙,形成了一个“筛子”,流动相中各组分通过凝胶柱时,不同分子大小的组分扩散速度不同,进而被分离。

凝胶过滤层析纯化蛋白的原理

凝胶过滤层析纯化蛋白

  样品通过凝胶层析柱时,样品中比凝胶孔隙大的大分子不能进入凝胶内部,进而被筛在了凝胶孔外,随着流动相向前流动,流出柱子的速度快;比凝胶孔小的分子进入凝胶内部,收到凝胶内部的阻力,并且需要穿透层层凝胶珠,路程长,流出柱子的速度慢。样品中分子量介于大分子和最小的分子之间的,在凝胶层中部分渗透,分子量越小渗透程度越大,最后流出柱子的速度越慢,分子量越大渗透程度越小,流出柱子的速度越快,根据不同组分流出的速度即可将不同大小的分子分离。

葡聚糖凝胶的选择

1. 凝胶颗粒的大小

  凝胶颗粒一般为球形,以其直径或目数来表示大小。层析柱的分辨率和样品流速取决于凝胶颗粒的大小,颗粒大,孔隙大,样品流速快,分离效过差;孔隙小,样品流速慢,分离效果好。
  葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex,不同规格用G表示,G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍,例如,G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克。Sephadex的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G-200,“G”反映,凝胶的交联程度,膨胀程度及分布范围。

规格 分离范围(Da) pH值稳定范围 建议流速(cm/h) 适用范围
10 <700 2-13 2-5 脱盐、肽与其它小分子的分离
15 <1500 2-13 2-5 脱盐、肽与其它小分子的分离
25 1000-5000 2-13 2-5 脱盐、肽与其它小分子的分离
50 1500-30000 2-10 2-5 多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定
75 3000-70000 2-10 72 蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定
100 4000-150000 2-10 47 蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定
150 5000-400000 2-10 21 蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定
200 5000-800000 2-10 11 蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定

2. 分级分离范围和排阻极限

分配系数:某个组分在固定相和流动相中分配的分子浓度比。
组别分离:样品中的大分子物质和小分子物质在凝胶过滤时,在分配系数上有显著差异。
排阻极限:是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。

  分级分离指在凝胶层析中,样品中组分分子量比较接近,选用排阻限度略大于最高分子量组分的凝胶类型,在凝胶层析过程中这些组分都能不同程度地渗透到凝胶内部,由于分配系数不同,最后在凝胶层析中可能得到分离。分级分离的目的在于使各组分的分配系数差异更大。

  在凝胶选择时,应该根据样品中的不同分子量选择不同型号的凝胶,不同型号的凝胶具有不同的分级分离范围,如果待分离样品的分子量在凝胶的分级分离范围内,用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3000—70000,它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。

  对于分子量比较接近的蛋白样品,一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶,层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部,根据蛋白分子量的不同而分离。

凝胶过滤层析纯化蛋白实验方法

1. 凝胶预处理及填料

1.1 如果凝胶过滤的介质是干粉,则需在凝胶过滤缓冲液中完全溶胀。
1.2 在避免直接光照的恒温环境中,将层折柱垂直安装在稳固的实验室支架上。
1.3 用一注射器将凝胶过滤缓冲液从柱子的输出管注入柱子,至缓冲液达到柱子支持体平面之上,注射器留在输出端以堵住柱子。
1.4 沿着一根顺柱子内壁而放的玻璃棒将凝胶混悬物倒入柱子至所设高度,再小心往凝胶顶部加入1 cm 高的一层缓冲液,并连接缓冲液贮存容器,取去堵着柱子输出管的注射器,用2~3倍柱床体积的缓冲液请洗柱子。
1.5 流尽柱子凝胶顶部上面的缓冲液、关闭其输出管。

2. 上样

2.1 样品要求

  凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。样品体积不应超过柱床体积的1~5 %,如超过5 %,则会导致分离效率降低,低于1 %则分离效率也不会提高,所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2,样品粘度过高,会使层析区带不稳定,或流速不规律,区带变宽或扭曲。上样前样品应经0.2 μm孔径滤膜过滤或10000 g离心5 min,去除残渣,加样时避免破坏柱体表面,保持其表面均匀平整。

2.2 加样

  层析柱经平衡后,待平衡液流至床表面以下 1~2 mm 时,关闭出口。不允许流干, 柱干后必须重装;
  用加样器将样品加至柱床表面以上 2~3 cm 时,接上恒压样品瓶,并打开出口,使样品渗胶内。样品加完后,用小体积的洗脱液洗表面 1~2 次,尽可能少稀释样品。当样品接近流干时,像加样品那样仔细地加入洗脱液,至床表面以上 2~5 cm 时,即可接上恒压洗脱瓶开始层析。以上所有操作步骤都须时刻注意层析表面的均勻性。

3. 样品洗脱

3.1 缓冲液流经层析柱进行洗脱直至目的蛋白被检出为止;
3.2 通常用蠕动泵控制层析柱的流速,使用泵的压力不要超过凝胶的耐受程度;
3.3 由于凝胶过滤层析经常需要进行数小时以上,为了避免层析柱流干,在不使用蠕动泵时,可在贮液瓶与层析柱上端入口入加一根软管其长度与柱的出口处持平,使缓冲液先流经软管再到达柱内。
3.4 用2~3个柱床体积的凝胶过滤缓冲液洗柱,凝胶珠保存在含0.02%叠氮钠的缓冲液中,可无限次地使用。

凝胶过滤层析常见问题解析