凝胶过滤色层析常见问题解析

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1.凝胶过滤色谱法进行蛋白纯化的原理是什么?

  凝胶过滤层析又称凝胶排阻色谱, 分子筛色谱法, 凝胶过滤法等。利用凝胶过滤介质为固定相,根据物料中溶质相对分子质量的差异的液相色谱法。只依据尺寸大小分离,大组分最先被洗提出。色谱固定相是多孔性凝胶,只有直径小于孔径的组分可以进入凝胶孔道。大组分不能进入凝胶孔洞而被排阻,只能沿着凝胶粒子之间的空隙通过,因而最大的组分最先被洗提出来。小组分可进入大部分凝胶孔洞,在色谱柱中滞留时间长,会更慢被洗提出来。溶剂分子因体积最小,可进入所有凝胶孔洞,因而是最后从色谱柱中洗提出。这也是与其他色谱法最大的不同。

凝胶过滤色谱法原理

2.凝胶过滤色谱法的优缺点

优点 缺点
1.易操作;
2.条件温和,不会使物质变性
3.分离效率高,回收率较高
4.可纯化的蛋白分子量范围宽
5.纯化过程中不需要能引起蛋白变性的有机溶剂
1.分辨率较低,需采用细长柱
2.上样量小
3.上样前需进行浓缩,对标本要求高
4.成本高,不适合工业化生产

3.凝胶过滤色谱的凝胶特性参数有那些?

(1) 排阻极限(exclusion limit) 是指不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子的分子量。(SephadexG-50的排阻极限是30kDa)。

(2) 分级范围(Fractionation range) 它指出了当溶液通过凝胶柱时,能够为介质阻滞并且分离的溶质分子量范围(SephadexG-50, 它的分级范围为1500—30000)。

(3) 吸水量(Water regains) 1g干凝胶所吸收的水分称为吸水量(SephadexG-50的吸水量为5.0±0.3g )。溶胀率=吸水量×100%。

(4) 凝胶粒径凝胶颗粒一般为球形,其粒径大小对分离度有重要影响(粒径越小,其分离效率越高)。100-200目(50-150μm)

(5) 床体积(Bed volume ) 表示1g干胶在溶胀后所具有的最后体积(SephadexG-50的床体积为9—11ml/g 干凝胶)

(6) 空隙体积(Void volume) 表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间即V0(用平均分子量为2000kDa蓝色葡聚糖测出) 。

4.实验流程

过程 注意事项
凝胶过滤介质选择 根据样品属性及凝胶过滤介质分级分离范围来选择
装柱 柱床高度控制在30-60cm
装填径高比在1:15-1:100
装填要均匀疏密适当
上样 上样流速要慢
上样体积影响分离效果
组群分离(如脱盐)可上样30%,组分分离上样量控制在10%以内
分离 样品进入柱床后,大于介质排阻上限的物质先流出柱床
在介质排阻范围内的物质,依据分子大小依次由大到小流出。

5.凝胶过滤色谱的操作过程与吸附色谱有那些主要区别?

吸附色谱固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂,所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。

6.凝胶过滤色谱主要应用于那些方面?

(1)脱盐及缓冲液的更换:由于蛋白质与盐的分子量相差较大,因此,很容易通过凝胶过滤色谱将二者分开;了更换缓冲液,可将平衡缓冲液和洗脱缓冲液使用需更换的缓冲液,这样,脱盐的同时即可将样品缓冲液进行更换。

(2)分级分离:当目标蛋白大于凝胶的排阻极限,而杂质处于排阻范围内时,容易得到较纯的目的蛋白;但事实上,由于凝胶的孔径具有一定的分布,要想将目标蛋白和杂蛋白完全分开,具有一定的难度

(3)分子量的测定:在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数(或洗脱体积)与相对分子质量的对数呈线性关系(KD=a-blgMW),所以,凝胶过滤色谱可用于未知物质相对分子质量的测定。