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磷酸化抗体，如何做到精准识别？磷酸化修饰是细胞信号转导的核心事件，制备能特异性识别磷酸化位点的抗体是多抗定制中的难点。本案例以客户提供的磷酸化多肽为抗原，偶联KLH免疫兔，经抗原亲和纯化后获得高效价、低交叉反应的磷酸化多克隆抗体。案例涵盖非磷酸化/磷酸化多肽质检、纯化前后效价对比及纯度检测，为磷酸化抗体定制提供完整参考。
01实验目的
以客户在钟鼎制备的磷酸化多肽抗原，偶联KLH免疫rabbit获得磷酸化多克隆抗体。
磷酸化抗体制备关键点：需同时合成磷酸化多肽与非磷酸化多肽，前者用于免疫，后者用于负筛选/交叉反应检测，确保抗体能区分磷酸化与非磷酸化状态。
02实验设计
- 以客户提供的目的序列设计免疫用多肽序列，合成非磷酸化多肽和磷酸化多肽，多肽偶联KLH；
- 磷酸化多肽免疫2只rabbit；
- 磷酸化多克隆抗体纯化。
1
序列设计
多肽合成
多肽合成
2
磷酸化/
非磷酸化质检
非磷酸化质检
3
KLH偶联
兔免疫
兔免疫
4
抗血清
采集
采集
5
抗原亲和
纯化
纯化
6
效价与
纯度检测
纯度检测
▲ 磷酸化多克隆抗体制备完整流程
03多肽合成与质检
3.1 非磷酸化多肽HPLC检测结果
| Sample ID: | ZD2018D00XXXX | |
| Sequence: | XXXXXXXXXXXX-C | |
| Column: | 4.6mm*250mm, GS-120-5-C18-BIO | |
| Calculation Type: | Percent | |
| Solvent A: | 0.1% Trifluoroacetic in 100% Acetonitrile | |
| Solvent B: | 0.1% Trifluoroacetic in 100% water | |
| Gradient: | A | B |
| 0.00min 20% | 80% | |
| 25min 45% | 55% | |
| 25.1min 100% | 0% | |
| 30min stop |
▲ 非磷酸化多肽HPLC纯度检测结果
3.2 非磷酸化多肽MS分析结果
| MW: | 1380.59 | Probe bias: | -3.5kv |
| Probe: | ESI | Detector: | 1.0kv |
| DL: | -20.0v | T.Flow: | 0.2ml/min |
| DL Temp: | 250℃ | B.conc: | 50%H2O/50%ACN |
| Block Temp: | 200℃ |
非磷酸化多肽的作用：作为负筛选抗原，用于检测和去除抗体对非磷酸化状态的交叉反应，是磷酸化抗体特异性的关键保障。
3.3 磷酸化多肽HPLC分析结果
▲ 磷酸化多肽HPLC纯度检测结果
3.4 磷酸化多肽MS检测结果
| MW: | 1460.57 | Probe bias: | -3.5kv |
| Probe: | ESI | Detector: | 1.0kv |
| DL: | -20.0v | T.Flow: | 0.2ml/min |
| DL Temp: | 250℃ | B.conc: | 50%H2O/50%ACN |
| Block Temp: | 200℃ |
分子量差异：磷酸化多肽MS检测MW为1460.57，非磷酸化多肽MW为1380.59，差值约80 Da，与一个磷酸基团（HPO₃，约80 Da）的添加一致，证实磷酸化修饰成功。
04纯化抗体效价检测
磷酸化
多肽A
多肽A
免疫原
目标抗原
非磷酸化
多肽B
多肽B
负筛选
交叉反应检测
纯化后
交叉反应
交叉反应
效价降至4K
▲ 磷酸化抗体特异性验证策略
纯化前：起始稀释度1:500，效价即样品OD/空白OD ≥2.1的最高稀释度。
通过ELISA检测结果得出，磷酸化多肽抗体针对磷酸化多肽A效价在512K左右，针对非磷酸化多肽B效价在512K左右。
交叉反应问题：纯化前抗体对磷酸化与非磷酸化多肽均有高响应，说明存在明显的交叉反应，需通过抗原亲和纯化去除。
纯化后：起始稀释度1:500，效价即样品OD/空白OD ≥2.1的最高稀释度。
通过ELISA检测结果得出，去除交叉反应的磷酸化多肽抗体针对磷酸化多肽A效价在512K左右，针对非磷酸化多肽B效价在4K左右。
纯化效果显著：抗原亲和纯化后，抗体对磷酸化多肽A效价保持512K，对非磷酸化多肽B交叉反应从512K降至4K，特异性提升128倍。
非磷酸化多肽B抗体：起始稀释度1:500，效价即样品OD/空白OD ≥2.1的最高稀释度。
通过ELISA检测结果得出，非磷酸化多肽B抗体针对磷酸化多肽A、非磷酸化多肽B效价均在256K左右。
05纯化后抗体纯度检测
▲ 纯化后抗体SDS-PAGE纯度检测
纯度评估：SDS-PAGE显示重链与轻链条带清晰，无明显杂带，纯度达85%以上，满足后续WB、IP等应用需求。
06结论
通过ELISA检测效价得出，磷酸化多肽抗体针对磷酸化多肽A效价在512K左右，针对非磷酸化多肽B效价在4K左右，纯度在85%以上，获得磷酸化抗体得率达到3.5 mg以上。
512K
磷酸化多肽效价
4K
交叉反应效价
85%+
抗体纯度
3.5mg+
抗体得率
本案例成功制备了高特异性磷酸化多克隆抗体，验证了磷酸化多肽+KLH偶联免疫结合抗原亲和纯化的技术路线，可为磷酸化抗体定制项目提供参考。
结语
磷酸化抗体制备的核心挑战在于区分磷酸化与非磷酸化状态。通过精心设计抗原、严格质检、免疫与抗原亲和纯化，可以获得高特异性磷酸化抗体。钟鼎生物拥有丰富的磷酸化抗体定制经验，欢迎咨询。
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