原核表达蛋白实验步骤
| 原核表达蛋白实验所需耗材、设备 | |
|---|---|
| 试剂和耗材 | |
| PET30a 空载体（Zoonbio保存） | TOP10 菌株（Zoonbio保种） |
| Arctic-ExpressTM表达菌（Zoonbio保种） | BL21（Plyss）表达菌（Zoonbio保种） |
| Rosetta表达菌（Zoonbio保种） | Protein Marker（购自Thermo公司） |
| IPTG、Acr、Bis、Tris（购自Sigma公司） | SDS（购自Amresco公司） |
| TEMED（购自BIO-RAD公司） | Tryptone、Yeast Extract（购自 OXOID公司） |
| 0.22 μm无菌滤器和透析袋（购自Millipore公司） | Ni-IDA亲和层析胶（购自Novagen公司） |
| 其它试剂均为国产分析纯 | |
| 主要实验仪器 | |
| Allegra 21R台式高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司） | 台式高速离心机（德国SORVAL公司） |
| Mini Protean II垂直平板电泳系统、GeL Doc2000成像系统（美国BIO-RAD公司） | 320-S pH计（美国MettLer ToLedo公司） |
| 雪花状制冰机（日本SANYO公司） | JY92-2D超声波细胞粉碎机（中国新芝科器研究所） |
| 超净工作台（中国苏净集团） | |
实验方法及结果
1.重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express 、BL21（DE）3Plyss和
(1)将质粒1 μL加入100 μL感受态细菌中，置冰上20 min。
(2)42℃热激90 sec，迅速置冰中5 min，加入600 μL LB培养液。
(3)37℃，220 r/min振摇1 h，离心后全部涂布于含50 μg/mL Amp或Kan的LB平板，37℃倒置培养过夜。
2. IPTG诱导重组表达菌融合蛋白的表达
(1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/mL Amp或Kan的3 mL LB培养液的试管中，37℃ 220 r/min振摇过夜。
(2)次日按1:100接种于50 μg/mL Amp或Kan的30 mL LB培养液中，37℃ 220 r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8。
(3)取出1 mL培养物，10000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。
(4)a.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5 mM， 37℃ 220 r/min振摇4 h，诱导融合蛋白表达。 b.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5 mM， 11℃ 220 r/min振摇过夜，诱导融合蛋白表达。
(5)取出1 mL培养物，10000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000 r/min，离心10 min，弃上清，用 PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。
(6)进行12% SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显条带。
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