因素 01一、目的蛋白的结构和功能

亲和标签与目的蛋白之间的作用是相互的，需要综合考虑：既要考虑对目的蛋白结构功能的影响，又要考虑对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际用途。

• 大多数情况首选短的多肽标签——对目的蛋白的结构影响最小。在某些应用中，短肽不必去除，因为重组蛋白已具有完全的生物学功能。这也是6个组氨酸标签比GST标签应用更广的原因。
• 短肽不具有免疫原性，融合蛋白可直接用于抗体的制备。
• 而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。

因素 02二、蛋白是否稳定

含有多对二硫键的蛋白质，或某些蛋白质在进行非融合表达时，容易形成包含体，或有降解发生。降解的原因有两种情况：

亲和标签对蛋白质包含体的形成可以促进，也可以减少，不同的标签有不同的特性，多数情况还与表达系统相关。

因素 03三、亲和标签的融合位置

亲和标签可以加在N端、C端，也可以进行串联。在选择融合位置时，要综合考虑以下因素：

• 位置对标签亲和性的影响：如GST适合加在N端。
• 融合可能对目的蛋白的影响：如果目的蛋白的C端序列包埋在蛋白质内部，那么进行C端融合就不合适。
• N端融合的优势：多数情况下蛋白质的N端区域对蛋白质的功能不是太重要，所以N端融合常常能保留蛋白质的生物学功能。
• N端对表达水平的影响：由于N端DNA序列对蛋白质的转录翻译影响较大，所以标签加在N端对蛋白质的表达水平影响更大，优化标签的mRNA结构可使表达水平提高。
• N端对溶解性的影响：N端标签对表达蛋白的溶解性影响更大，如在N端使用天然HAT标签比6×His标签有助于目的蛋白的可溶性表达，而N端进行MBP融合表达也常用来提高目的蛋白的溶解性。
• 分泌表达的特殊要求：进行分泌表达时常选用可分泌的亲和标签，有些亲和标签不适合放在N端——如6×His标签放在N端会影响重组蛋白信号肽的处理和目的蛋白的分泌，这是因为6×His标签具有多个带电咪唑残基。
• 标签去除后的残留问题：C端融合表达时，去除融合标签后目的蛋白的C端会有几个氨基酸残留；而N端融合表达可以在去除标签后得到完整的天然目的蛋白。

重组蛋白亲和标签选择示意

因素 04四、是否需要在变性条件下进行亲和纯化

如果融合蛋白以包含体的形式存在，由于大多数的亲和标签不适于在变性剂存在条件下进行亲和纯化，只能先进行包含体的溶解和复性，再在非变性条件下进行亲和纯化。

因素 05五、亲和标签对表达水平的影响

亲和标签对表达水平的影响不仅与亲和标签和目的蛋白相关，还与可用的表达纯化系统密切相关，需根据具体情况进行分析。

因素 06六、是否需要标签具有鉴定功能

如果对于目的蛋白没有方便有效的分析鉴定方法，可选择具有鉴定功能的亲和标签。

具有鉴定功能的标签包括：

• FLAG标签：可用单抗M1/M2进行检测。
• S标签：可用RNase A的S片段进行检测，可用于表达水平的监测。
• T7标签：可用单抗检测。
• GST标签：可进行表达蛋白的检测。
• PinPoint：可进行表达蛋白的检测。
• Strep tag II：可进行表达蛋白的检测。

因素 07七、亲和洗脱的条件

在下表中列出了常用亲和融合表达/纯化系统的洗脱条件。有些条件比较温和，而有些条件较为剧烈，选择的亲和表达系统应该不使目的蛋白变性。

因素 08八、是否在亲和纯化后去除标签

融合蛋白是否需要去除标签，由目的蛋白的用途和标签的特点来确定：

因素 09九、成本因素

亲和介质和缓冲液的费用也是选择亲和标签时需要考虑的重要因素。大规模纯化时，介质用量大、成本高，需要综合权衡。

速查十、亲和标签选择速查表