GST蛋白包涵体表达纯化过程
| GST蛋白包涵体表达纯化实验所需耗材、设备 | |
|---|---|
| 试剂和耗材 | |
| pGEX-4T-1 质粒（Zoonbio保存） | TOP10 克隆菌株（Zoonbio保种） |
| Arctic-Express™表达菌（Zoonbio保种） | Protein Marker（购自Thermo公司） |
| IPTG、Acr、Bis、Tris（购自Sigma公司） | SDS（购自Amresco公司） |
| TEMED（购自BIO-RAD公司） | Tryptone、Yeast Extract（购自 OXOID公司） |
| 0.22 μm无菌滤器和透析袋（购自Millipore公司） | GST亲和层析胶（购自GE公司） |
| 其它试剂均为国产分析纯 | |
| 主要实验仪器 | |
| Allegra 21R台式高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司） | 台式高速离心机（德国SORVAL公司） |
| Mini Protean II垂直平板电泳系统、GeL Doc2000成像系统（美国BIO-RAD公司） | PTC-200基因扩增仪（美国MJ Research公司） |
| 320-S pH计（美国MettLer ToLedo公司） | 雪花状制冰机（日本SANYO公司） |
| JY92-2D超声波细胞粉碎机（中国新芝科器研究所） | 超净工作台（中国苏净集团） |
实验方法及结果
1.重组载体转化至大肠杆菌Arctic Express
(1)将质粒1 μL加入100 μL感受态细菌中，置冰上30 min。
(2)42℃热激90 sec，迅速置冰中5 min，加入600 μL LB培养液。
(3)37℃，220 r/min振摇40min，离心后全部涂布于含50 μg/mL Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。
2.IPTG诱导重组载体载体融合蛋白表达
(1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/mL Amp的3 mL LB培养液的试管中，37℃ 200 r/min振摇过夜。
(2)次日按1:100接种于50 μg/mL Amp的30 mL LB培养液中，37℃ 200 r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8。
(3)取出1 mL培养物，10000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。
(4)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mM，15℃ 200 r/min振摇过夜，诱导融合蛋白表达。
(5)取出1 mL培养物，10000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000 r/min，离心10 min，弃上清，用 PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀加入上样缓冲液重悬。
(6)进行12% SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显条带。
3.包涵体蛋白的变复性
(1)将菌体沉淀重悬于20 mL Lysis buffer（20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0），超声破碎（功率400 W，工作4 sec，间歇8 sec，共10 min）。
(2)将超声破碎的细胞裂解液4℃ 10000 r/min离心20 min，收集沉淀。
(3)使用包涵体洗涤液（20 mM Tris，1 mM EDTA，2 M尿素，1 M NaCl，1％Triton X-100，pH 8.0）洗涤包涵体3次。
(4)用溶解缓冲液（20 mM Tris，5 mM DTT，8 M尿素，pH 8.0），按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000 r/min离心15 min。
(5)将上述溶液滴加20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH 8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH 8.0溶液中透析过夜。4℃ 10000 r/min离心20 min，收集上清。
4.融合蛋白的GST柱亲和纯化及结果分析
(1)利用低压层析系统，包涵体复性溶液以0.5 mL/min流速上样至GST Binding-Buffer预平衡的GST亲和层析柱。
(2)用GST Binding-Buffer以0.5 mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。
(3)用GST Elution-Buffer（20 mM Tris-HCl，50 mM GSH，0.15 M NaCl，pH 8.0）以1 mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。
(4)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH 8.0进行透析过夜。
(5)进行12% SDS-PAGE分析。
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