倒一个普通的无抗性的 LA 培养皿，利用感受态菌株，划单菌落，37℃ 培养约 15 hrs（推荐时间：第一天 8:00 am - 11:00 pm）。

用 20 ml 的半盐 LB 培养基接菌，摇菌约 11 hrs（推荐时间：第一天 11:00 pm - 第二天 10:00 am）。

将菌液接入 200 ml/瓶的半盐 LB 培养基中，每瓶 2 ml（1% 体积比），扩大培养细菌约 3 hr（第二天 11:00 am - 2:30 pm）。根据不同的感受态菌株，从 2.5 hr 起开始吸 1 ml 菌液测 OD 值，当 OD₆₀₀ 值为 0.4-0.6 之间时，细菌处于指数生长前期。将摇好的菌液放在冰上预冷 10 min 以上（半小时），并不间断摇匀菌液（期间摇晃数次使菌体温度均匀）。以下所有操作均在冰上进行。

离心机 4℃ 预冷。将预冷的菌液倒入 4 个 500 ml 离心管中，利用天平两两配平，4℃ 5000 rpm 离心 12 min 收集菌体，弃去上清，用灭菌吸水纸擦干瓶口。

先加入 5 ml 左右的预冷双蒸水，用移液器上下吸动将菌体捶打均匀，并将 4 瓶菌体两两合并成为 2 瓶。每瓶倒入灭菌双蒸水约 400 ml，利用天平配平，剧烈震荡数次以保证混匀，4℃ 4000 rpm 离心 12 min 收集菌体，弃上清，注意勿将菌体倒出，并用灭菌吸水纸擦干瓶口。

重复以上操作，利用预冷的 10% 甘油代替灭菌双蒸水清洗两次，并且将两瓶菌体合并成为一瓶，利用废弃液体配平离心。

视最后的菌体的体积加入适量 10% 甘油（清洗过程中菌体损失会导致菌体较少则少加甘油；最后一次离心后弃上清时残留的液体过多则少加或不加；正常情况下推荐加 10% 甘油 2.5 ml）。利用移液器将菌体上下吸动吹打均匀，将菌液转移到 1.5 ml 或 2 ml 的离心管（冰上）。并分装至 500 μl 离心管中，30 μl/管，放入液氮中冷冻后，于 -80℃ 冰箱保存。