酵母双杂交筛库(核文库体系)质量标准及实验流程

你造吗?酵母双杂交实验距今已有26年的历史,尽管是一个成熟的技术,但是因为其实验系统复杂,细节众多,同一实验条件下的结果往往千差万别。本文我们结合钟鼎的实例,深入解析酵母双杂交筛库的几个重要节点(诱饵基因测序、诱饵基因毒性检测、自激活检测、初筛、复筛、回转验证、点板验证)的质量标准及实验流程。


一、诱饵验证

为避免因序列差异造成对后期实验结果的影响,需要对原始克隆pGBKT7-xxxx 进行测序和比对分析。

将测序结果与客户提供的参考序列进行比对,结果表明序列一致。

结论:诱饵克隆 xxxx 序列正确,可继续进行后续实验。


二、xxxx 诱饵基因毒性和自激活检测

以质粒 pGBKT7-Lam Control Vector 和 pGADT7-T Control Vector 为阴性对照,质粒pGBKT7-53 Control Vector 和 pGADT7-T Control Vector 为阳性对照。

1.将 Y2H Gold 酵母菌种在 YPDA 平板上划线,30°C 培养箱倒置培养 3 天左右,直到克隆大小为 2 - 3 mm;
2.挑取一个酵母克隆于 3 ml 的 YPDA 培养基中(15 ml 灭菌的离心管);在 30°C摇床振荡培养 8 h;
3.吸取 5 μl 至 50 ml YPDA 中(250 ml 三角瓶),在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 16 - 20 h,直至 OD600 = 0.15 - 0.3;
4.室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体;
5.倒去上清并用 100 ml YPDA 重悬酵母;在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 3– 5 h,至 OD600 = 0.4 - 0.5;
6.室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体,倒去上清并用 60 ml 无菌去离子水重悬酵母;
7.室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体,倒去上清并用 3 ml 1.1 x TE/LiAc 溶液重悬酵母;
8.将重悬液分装为 3 个 1.5 ml 的离心管;高速离心 15 s;
9.倒去上清并将酵母重悬于 600 μl 1.1 x TE/LiAc 溶液;
10.按照下表构建反应:

反应 BD质粒(各 300ng) AD质粒(各 300ng) 涂板类型 备注
1 pGBKT7-53 pGADT7-T DDO/TDO/QDO 阳性对照
2 pGBKT7-lam pGADT7-T DDO/TDO/QDO 阴性对照
3 pGBKT7- xxxx pGADT7 DDO/TDO/QDO 自激活检测
4 pGBKT7- xxxx —— SD/-Trp 毒性检测

11.每管反应中加入 5 μl 预变性的 Carrier DNA、300 μl 1 x PEG/LiAc 溶液,混匀;
12.每管反应中加入 50 μl 重悬酵母感受态细胞,缓慢混匀;
13.30°C 水浴 30 min,每 10 min 混匀一次;
14.每管加入 20 μl DMSO,混匀;
15.42°C 水浴热激 15 min,每 5 min 上下颠倒混匀一次;
16.700 g 离心 5 min;
17.弃掉上清,用 0.2 ml YPD Plus 液体培养基重新悬浮;注:YPD Plus 是特别配制的增强转化;这个步骤不使用 YPD 培养基;
18.30°C 摇床振荡复苏培养,合适时间(1 h);
19.高速离心 15 s;
20.弃掉上清,用100 μl 0.9% NaCl 溶液重新悬浮细胞。取10 μl 重悬液,稀释100 x涂平板。
上表构建反应结果如下:

1)pGBKT7-xxxx 毒性检测结果:

毒性检测结果 毒性检测结果
pGBKT7 pGBKT7-xxxx

图 1 SD/-Trp

结论: Bait 质粒 pGBKT7-xxxx 转入 Y2HGold 后,菌落生长情况同 pGBKT7 空载转化酵母后的一致, 表明 pGBKT7-xxxx 质粒对酵母细胞均无毒性。

2)阳性对照

阳性对照 阳性对照
DDO QDO

图 2 阳性对照

3)阴性对照

阴性对照 阴性对照
DDO QDO

图 3 阴性对照

4)自激活检测结果

自激活检测结果 自激活检测结果 自激活检测结果
DDO TDO QDO

图 4 自激活检测结果

结论: pGBKT7-53 Control Vector 和 pGADT7-T Control Vector 于 DDO、TDO、QDO 培养基中都有 克隆生长,阳性对照实验成功。pGBKT7-Lam Control Vector 和 pGADT7-T Control Vector 于 DDO 培养基上生长但在 TDO 和 QDO 培养基上无克隆生长,阴性对照实验成功。BD 基因pGBKT7-xxxx+pGADT7 在 DDO 上生长,说明 pGBKT7-xxxx 质粒成功转入酵母菌株中,在 TDO 有轻微生长 QDO 培养基上不生长,说明 pGBKT7-xxxx 在 Y2H Gold 酵母菌株中有轻 微激活活性,可以进行后续筛选。


三、文库筛选

将正确 pGBKT7-xxxx 诱饵质粒和文库质粒共同转入 Y2H 感受态细胞中,涂 TDO 平板。

1、将 Y2H Gold 酵母菌种在 YPDA 平板上划线,30°C 培养箱倒置培养 3 天左右,直到克隆大小为 2 - 3 mm;
2、挑取一个酵母克隆于 3 ml 的 YPDA 培养基中(15 ml 灭菌的离心管);在 30°C 摇床 250 rpm 振荡培养 8 h;
3、吸取 5 μl 至 50 ml YPDA 中(250 ml 三角瓶),在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振 荡培养 16 - 20 h,直至 OD600 = 0.15 - 0.3;
4、室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体;
5、倒去上清并用 100 ml YPDA 重悬酵母;在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 3 – 5 h,至 OD600 = 0.4 - 0.5;
6、室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体,倒去上清并用 60 ml 无菌去离子水重悬酵 母;
7、室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体,倒去上清并用 3 ml 1.1 x TE/LiAc 溶液重悬 酵母;同时将 Carrier DNA 预变性两次;
8、高速离心 15 s,收集菌体,加入 600 μl 1.1 x TE/LiAc 重悬菌体;
9、加入 10 μg 酵母文库质粒,加入 5 μg BD 质粒、50 μl 预变性的 Carrier DNA, 轻轻混匀;
10、加入 2.5 ml 1 x PEG/LiAc,混匀;
11、30°C 水浴 45 min,每 15 min 摇匀一次;
12、加入 160 μl DMSO,轻轻混匀;
13、42°C 水浴热激 20 min,每 10 min 上下颠倒混匀一次;
14、700 g 离心 5 min,收集菌体;
15、加入 3 ml YPD Plus,30°C 摇床振荡培养 90 min;
16、700 g 离心 5 min,收集菌体;
17、加入 0.9% NaCl 悬浮菌体,终体积 6 ml 左右;取 100 μl 1/10、1/100 稀释液 涂布 100 mm SD/-Trp/-Leu 平板,用于计算转化效率;

酵母双杂交核文库案例图

其余菌液涂布于 TDO 平板上,150 μl /块,约 50 块;30°C 恒温培养箱培养 3 - 5天,单克隆长出至大小 1 - 2 mm,初筛完成。

初筛图片

初筛图片 初筛图片
初筛-1 TDO 初筛-2 TDO

图 5 初筛结果

结论:初筛结果,使用 TDO 平板进行筛选,初筛筛选到 34 个克隆。


四、二次筛选

为了去除假阳性将初筛平板上的克隆,将初筛平板上生长的 34 个克隆,全部点到QDO/AbA/X-α-Gal 平板。

二次筛选图片如下:

二次筛选图片

QDO/AbA/X-α-Gal

图 6 复筛结果

结论: 复筛由图 6 得知:二次筛选后有 5 号、9 号、12 号、17 号、19 号五个有轻微生长但不变蓝, 所以得到 29 个阳性克隆。


五、阳性克隆鉴定

将二次筛选平板上生长显蓝斑的29 个阳性克隆进行菌落PCR 测序,得到29 个测序结果。


六、阳性分离和质粒提取

1、取 1-5mL 酵母培养物(不超过 5×107cells),12000rpm 离心 1min,尽量吸除上 清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中);
2、酵母细胞壁的破除:
A、酶法:向酵母菌体中加入 470μL 山梨醇 Buffer,充分悬浮菌体,加入 25μL 酵母 破壁酶和 5μL 巯基还原剂,充分混匀,30℃处理 1-2h,期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm 离心 1min,弃上清,收集沉淀,向沉淀中加入 250μL YP1(请先检查是否已加入 RNaseA), 充分悬浮沉淀(注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低);
B、玻璃珠法:向酵母菌体中加入 250μL YP1(请先检查是否已加入 RNaseA),充 分悬浮沉淀。加入 150-200μL 酸洗玻璃珠(自备),漩涡振荡 10min。简短离心使玻璃珠 沉降到离心管底,吸取上清(如上清有所损失,请用 YP1 补足至 250μL)于另一干净离心 管中;
3、向离心管中加入 250μL YP2,温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解(注意:混匀 一定要温和,以免污染酵母基因组 DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,作用时间不要超过 5 min,以免质粒受到破坏);
4、向离心管中加入 350μL YP3,立即温和地上下翻转 6-8 次,充分混匀,此时会出现 白色絮状沉淀。12000rpm 离心 20 min,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管 中,尽量不要吸出沉淀(注意:YP3 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀,如果上清中 还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清);
5、将上一步所得上清液加入吸附柱中,室温放置 2min,12000rpm 离心 1min,倒掉 收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;
6、向吸附柱中加入 600μL 漂洗液Ⅰ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm 离心 1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;
7、向吸附柱中加入 600μL 漂洗液Ⅱ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm 离心 1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中;
8、重复操作步骤 7;
9、12000rpm 离心 2min,将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟,目的是将 吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR 等;
10、将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加 50-200μL 经 65℃水 浴预热的洗脱液,室温放置 2min,12000rpm 离心 1min;
11、(可选)为了增加质粒的回收效率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放 置 2min, 12000rpm 离心 1min;
12、将洗脱后的酵母质粒进行大肠杆菌转化涂 Amp+抗性平板分离 AD 质粒,扩增提 取和测序验证。


七、回转验证

1、将 Y2H Gold 酵母菌种在 YPDA 平板上划线,30°C 培养箱倒置培养 3 天左右,直到克隆大小为 2 - 3 mm;
2、挑取一个酵母克隆于 3 ml 的 YPDA 培养基中(15 ml 灭菌的离心管);在 30°C 摇 床振荡培养 8 h;
3、吸取 5 μl 至 50 ml YPDA 中(250 ml 三角瓶),在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振 荡培养 16 - 20 h,直至 OD600 = 0.15 - 0.3;
4、室温 700 x g 离心 5 min 以收集菌体;
5、倒去上清并用 100 ml YPDA 重悬酵母;在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 3 – 5 h,至 OD600 = 0.4 - 0.5;
6、室温 700 x g 离心 5 min 以收集菌体,倒去上清并用 60 ml 无菌去离子水重悬酵母;
7、室温 700 x g 离心 5 min 以收集菌体,倒去上清并用 3 ml 1.1 x TE/LiAc 溶液重悬 酵母;
8、将重悬液分装为 3 个 1.5 ml 的离心管;高速离心 15 s;
9、倒去上清并将酵母重悬于 600 μl 1.1 x TE/LiAc 溶液;
10、按照诱饵质粒和猎物质粒各 300ng 构建一个返样体系;
11、每管反应中加入 5 μl 预变性的 Carrier DNA、300 μl 1 x PEG/LiAc 溶液,混匀;
12、每管反应中加入 50 μl 重悬酵母感受态细胞,缓慢混匀;
13、30°C 水浴 30 min,每 10 min 混匀一次;
14、每管加入 20 μl DMSO,混匀;
15、42°C 水浴热激 15 min,每 5 min 上下颠倒混匀一次;
16、700 g 离心 5 min;
17、弃掉上清,用 0.2 ml YPD Plus 液体培养基重新悬浮;注:YPD Plus 是特别配制 的增强转化;这个步骤不使用 YPD 培养基;
18、30°C 摇床振荡复苏培养,合适时间(1 h);
19、高速离心 15 s;
20、弃掉上清,用 100 μl 0.9% NaCl 溶液重新悬浮细胞。取 10 μl 重悬液,稀释 100 x 涂 DDO 和 QDO 平板,30℃培养箱培养 3-5 天,预计有阳性克隆长出。


回转验证(部分图片):

回转验证 回转验证
DDO 1 QDO 1
回转验证 回转验证
DDO 2 QDO 2

图 7 回转验证

结论: 本次筛选初筛筛选到 34 个克隆,经过二次筛选得到 29 个阳性克隆,将 29 个阳性克隆全部分离 AD 质粒进行回转验证,其中 3 号克隆活化失败,取消实验,其余 28 个质粒提取成功。 28 个质粒测序结果分析后发现 2 号、6 号、30 号与阳性克隆测序结果不一致,以质粒测序 结果为准。6 号和 30 号无互作,去除重复本次筛选共得到 24 个阳性基因。


八、点板验证

挑取感兴趣的蛋白在 DDO 和 QDO/A/X 平板上进行稀释点板,(可依据文章需求,进行个性化展示)结果如下:

点板验证
点板验证
点板验证

图 8 点板验证

结论:点板验证和回转验证结果一致。







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