你造吗？酵母双杂交实验距今已有26年的历史，尽管是一个成熟的技术，但是因为其实验系统复杂，细节众多，同一实验条件下的结果往往千差万别。本文我们结合钟鼎的实例，深入解析酵母双杂交筛库的几个重要节点（诱饵基因测序、诱饵基因毒性检测、自激活检测、初筛、复筛、回转验证、点板验证）的质量标准及实验流程。

一、诱饵验证

为避免因序列差异造成对后期实验结果的影响，需要对原始克隆pGBKT7-xxxx 进行测序和比对分析。

将测序结果与客户提供的参考序列进行比对，结果表明序列一致。

结论：诱饵克隆 xxxx 序列正确，可继续进行后续实验。

二、xxxx 诱饵基因毒性和自激活检测

以质粒 pGBKT7-Lam Control Vector 和 pGADT7-T Control Vector 为阴性对照，质粒pGBKT7-53 Control Vector 和 pGADT7-T Control Vector 为阳性对照。

1.将 Y2H Gold 酵母菌种在 YPDA 平板上划线，30°C 培养箱倒置培养 3 天左右，直到克隆大小为 2 - 3 mm；
2.挑取一个酵母克隆于 3 ml 的 YPDA 培养基中（15 ml 灭菌的离心管）；在 30°C摇床振荡培养 8 h；
3.吸取 5 μl 至 50 ml YPDA 中（250 ml 三角瓶），在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 16 - 20 h，直至 OD600 = 0.15 - 0.3；
4.室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体；
5.倒去上清并用 100 ml YPDA 重悬酵母；在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 3– 5 h，至 OD600 = 0.4 - 0.5；
6.室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体，倒去上清并用 60 ml 无菌去离子水重悬酵母；
7.室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体，倒去上清并用 3 ml 1.1 x TE/LiAc 溶液重悬酵母；
8.将重悬液分装为 3 个 1.5 ml 的离心管；高速离心 15 s；
9.倒去上清并将酵母重悬于 600 μl 1.1 x TE/LiAc 溶液；
10.按照下表构建反应：

反应	BD质粒(各 300ng)	AD质粒(各 300ng)	涂板类型	备注
1	pGBKT7-53	pGADT7-T	DDO/TDO/QDO	阳性对照
2	pGBKT7-lam	pGADT7-T	DDO/TDO/QDO	阴性对照
3	pGBKT7- xxxx	pGADT7	DDO/TDO/QDO	自激活检测
4	pGBKT7- xxxx	——	SD/-Trp	毒性检测

11.每管反应中加入 5 μl 预变性的 Carrier DNA、300 μl 1 x PEG/LiAc 溶液，混匀；
12.每管反应中加入 50 μl 重悬酵母感受态细胞，缓慢混匀；
13.30°C 水浴 30 min，每 10 min 混匀一次；
14.每管加入 20 μl DMSO，混匀；
15.42°C 水浴热激 15 min，每 5 min 上下颠倒混匀一次；
16.700 g 离心 5 min；
17.弃掉上清，用 0.2 ml YPD Plus 液体培养基重新悬浮；注：YPD Plus 是特别配制的增强转化；这个步骤不使用 YPD 培养基；
18.30°C 摇床振荡复苏培养，合适时间（1 h）；
19.高速离心 15 s；
20.弃掉上清，用100 μl 0.9% NaCl 溶液重新悬浮细胞。取10 μl 重悬液，稀释100 x涂平板。
上表构建反应结果如下：

1）pGBKT7-xxxx 毒性检测结果：

pGBKT7	pGBKT7-xxxx

图 1 SD/-Trp

结论： Bait 质粒 pGBKT7-xxxx 转入 Y2HGold 后，菌落生长情况同 pGBKT7 空载转化酵母后的一致， 表明 pGBKT7-xxxx 质粒对酵母细胞均无毒性。

2）阳性对照

DDO	QDO

图 2 阳性对照

3）阴性对照

DDO	QDO

图 3 阴性对照

4）自激活检测结果

DDO	TDO	QDO

图 4 自激活检测结果

结论： pGBKT7-53 Control Vector 和 pGADT7-T Control Vector 于 DDO、TDO、QDO 培养基中都有 克隆生长，阳性对照实验成功。pGBKT7-Lam Control Vector 和 pGADT7-T Control Vector 于 DDO 培养基上生长但在 TDO 和 QDO 培养基上无克隆生长，阴性对照实验成功。BD 基因pGBKT7-xxxx+pGADT7 在 DDO 上生长，说明 pGBKT7-xxxx 质粒成功转入酵母菌株中，在 TDO 有轻微生长 QDO 培养基上不生长，说明 pGBKT7-xxxx 在 Y2H Gold 酵母菌株中有轻 微激活活性，可以进行后续筛选。

三、文库筛选

将正确 pGBKT7-xxxx 诱饵质粒和文库质粒共同转入 Y2H 感受态细胞中，涂 TDO 平板。

1、将 Y2H Gold 酵母菌种在 YPDA 平板上划线，30°C 培养箱倒置培养 3 天左右，直到克隆大小为 2 - 3 mm；
2、挑取一个酵母克隆于 3 ml 的 YPDA 培养基中（15 ml 灭菌的离心管）；在 30°C 摇床 250 rpm 振荡培养 8 h；
3、吸取 5 μl 至 50 ml YPDA 中（250 ml 三角瓶），在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振 荡培养 16 - 20 h，直至 OD600 = 0.15 - 0.3；
4、室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体；
5、倒去上清并用 100 ml YPDA 重悬酵母；在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 3 – 5 h，至 OD600 = 0.4 - 0.5；
6、室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体，倒去上清并用 60 ml 无菌去离子水重悬酵 母；
7、室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体，倒去上清并用 3 ml 1.1 x TE/LiAc 溶液重悬 酵母；同时将 Carrier DNA 预变性两次；
8、高速离心 15 s，收集菌体，加入 600 μl 1.1 x TE/LiAc 重悬菌体；
9、加入 10 μg 酵母文库质粒，加入 5 μg BD 质粒、50 μl 预变性的 Carrier DNA， 轻轻混匀；
10、加入 2.5 ml 1 x PEG/LiAc，混匀；
11、30°C 水浴 45 min，每 15 min 摇匀一次；
12、加入 160 μl DMSO，轻轻混匀；
13、42°C 水浴热激 20 min，每 10 min 上下颠倒混匀一次；
14、700 g 离心 5 min，收集菌体；
15、加入 3 ml YPD Plus，30°C 摇床振荡培养 90 min；
16、700 g 离心 5 min，收集菌体；
17、加入 0.9％ NaCl 悬浮菌体，终体积 6 ml 左右；取 100 μl 1/10、1/100 稀释液 涂布 100 mm SD/-Trp/-Leu 平板，用于计算转化效率；

其余菌液涂布于 TDO 平板上，150 μl /块，约 50 块；30°C 恒温培养箱培养 3 - 5天，单克隆长出至大小 1 - 2 mm，初筛完成。

初筛图片

初筛-1 TDO	初筛-2 TDO

图 5 初筛结果

结论：初筛结果，使用 TDO 平板进行筛选，初筛筛选到 34 个克隆。

四、二次筛选

为了去除假阳性将初筛平板上的克隆，将初筛平板上生长的 34 个克隆，全部点到QDO/AbA/X-α-Gal 平板。

二次筛选图片如下：

QDO/AbA/X-α-Gal

图 6 复筛结果

结论： 复筛由图 6 得知：二次筛选后有 5 号、9 号、12 号、17 号、19 号五个有轻微生长但不变蓝， 所以得到 29 个阳性克隆。

五、阳性克隆鉴定

将二次筛选平板上生长显蓝斑的29 个阳性克隆进行菌落PCR 测序，得到29 个测序结果。

六、阳性分离和质粒提取

1、取 1-5mL 酵母培养物（不超过 5×107cells），12000rpm 离心 1min，尽量吸除上 清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）；
2、酵母细胞壁的破除：
A、酶法：向酵母菌体中加入 470μL 山梨醇 Buffer，充分悬浮菌体，加入 25μL 酵母 破壁酶和 5μL 巯基还原剂，充分混匀，30℃处理 1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm 离心 1min，弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入 250μL YP1（请先检查是否已加入 RNaseA）， 充分悬浮沉淀（注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）；
B、玻璃珠法：向酵母菌体中加入 250μL YP1（请先检查是否已加入 RNaseA），充 分悬浮沉淀。加入 150-200μL 酸洗玻璃珠（自备），漩涡振荡 10min。简短离心使玻璃珠 沉降到离心管底，吸取上清（如上清有所损失，请用 YP1 补足至 250μL）于另一干净离心 管中；
3、向离心管中加入 250μL YP2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解（注意：混匀 一定要温和，以免污染酵母基因组 DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏）；
4、向离心管中加入 350μL YP3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时会出现 白色絮状沉淀。12000rpm 离心 20 min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管 中，尽量不要吸出沉淀（注意：YP3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中 还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）；
5、将上一步所得上清液加入吸附柱中，室温放置 2min，12000rpm 离心 1min，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
6、向吸附柱中加入 600μL 漂洗液Ⅰ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
7、向吸附柱中加入 600μL 漂洗液Ⅱ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm 离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；
8、重复操作步骤 7；
9、12000rpm 离心 2min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将 吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR 等；
10、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 50-200μL 经 65℃水 浴预热的洗脱液，室温放置 2min，12000rpm 离心 1min；
11、(可选)为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放 置 2min， 12000rpm 离心 1min；
12、将洗脱后的酵母质粒进行大肠杆菌转化涂 Amp+抗性平板分离 AD 质粒，扩增提 取和测序验证。

七、回转验证

1、将 Y2H Gold 酵母菌种在 YPDA 平板上划线，30°C 培养箱倒置培养 3 天左右，直到克隆大小为 2 - 3 mm；
2、挑取一个酵母克隆于 3 ml 的 YPDA 培养基中（15 ml 灭菌的离心管）；在 30°C 摇 床振荡培养 8 h；
3、吸取 5 μl 至 50 ml YPDA 中（250 ml 三角瓶），在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振 荡培养 16 - 20 h，直至 OD600 = 0.15 - 0.3；
4、室温 700 x g 离心 5 min 以收集菌体；
5、倒去上清并用 100 ml YPDA 重悬酵母；在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 3 – 5 h，至 OD600 = 0.4 - 0.5；
6、室温 700 x g 离心 5 min 以收集菌体，倒去上清并用 60 ml 无菌去离子水重悬酵母；
7、室温 700 x g 离心 5 min 以收集菌体，倒去上清并用 3 ml 1.1 x TE/LiAc 溶液重悬 酵母；
8、将重悬液分装为 3 个 1.5 ml 的离心管；高速离心 15 s；
9、倒去上清并将酵母重悬于 600 μl 1.1 x TE/LiAc 溶液；
10、按照诱饵质粒和猎物质粒各 300ng 构建一个返样体系；
11、每管反应中加入 5 μl 预变性的 Carrier DNA、300 μl 1 x PEG/LiAc 溶液，混匀；
12、每管反应中加入 50 μl 重悬酵母感受态细胞，缓慢混匀；
13、30°C 水浴 30 min，每 10 min 混匀一次；
14、每管加入 20 μl DMSO，混匀；
15、42°C 水浴热激 15 min，每 5 min 上下颠倒混匀一次；
16、700 g 离心 5 min；
17、弃掉上清，用 0.2 ml YPD Plus 液体培养基重新悬浮；注：YPD Plus 是特别配制 的增强转化；这个步骤不使用 YPD 培养基；
18、30°C 摇床振荡复苏培养，合适时间（1 h）；
19、高速离心 15 s；
20、弃掉上清，用 100 μl 0.9% NaCl 溶液重新悬浮细胞。取 10 μl 重悬液，稀释 100 x 涂 DDO 和 QDO 平板，30℃培养箱培养 3-5 天，预计有阳性克隆长出。

回转验证（部分图片）：

DDO 1	QDO 1
DDO 2	QDO 2

图 7 回转验证

结论： 本次筛选初筛筛选到 34 个克隆，经过二次筛选得到 29 个阳性克隆，将 29 个阳性克隆全部分离 AD 质粒进行回转验证，其中 3 号克隆活化失败，取消实验，其余 28 个质粒提取成功。 28 个质粒测序结果分析后发现 2 号、6 号、30 号与阳性克隆测序结果不一致，以质粒测序 结果为准。6 号和 30 号无互作，去除重复本次筛选共得到 24 个阳性基因。

八、点板验证

挑取感兴趣的蛋白在 DDO 和 QDO/A/X 平板上进行稀释点板，（可依据文章需求，进行个性化展示）结果如下：

图 8 点板验证

结论：点板验证和回转验证结果一致。

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