酵母双杂交实验中假阳性是很普遍的情况，咱们筛库找互作，最头疼的就是假阳性淹没了真信号。关于真假阳性，其实核心区别就两点：
真阳性： 必须是诱饵（Bait）和猎物（Prey）凑一块儿才能把报告基因激活了。
假阳性： 是猎物自己（Prey alone）就有本事激活报告基因，跟诱饵没关系！这种“自激活”的猎物是假阳性的主要来源。

关键对照

要揪出假阳性，首先需要做一个至关重要的对照“pGBKT7++验证猎物”，这里我们总结一个结果对照表。

真阳性 vs. 假阳性 结果对照表 (关键！)

真阳性	实验组	平板	是否生长	颜色
	诱饵+验证猎物	DDO/X	生长	蓝色
		QDO/X/A	生长	蓝色
	pGBKT7++验证猎物	DDO/X	生长	白色
		QDO/X/A	不生长	/

假阳性	实验组	平板	是否生长	颜色	颜色
	诱饵+验证猎物	DDO/X	生长	蓝色	四种平板上的菌落量基本一致。
		QDO/X/A	生长	蓝色
	pGBKT7++验证猎物	DDO/X	生长	蓝色
		QDO/X/A	生长	蓝色

几点经验之谈和容易忽略的细节

菌落量差异：

理论上，具有阳性相互作用的克隆在 DDO/X 和 QDO/X/A 平板上应表现出相似的菌落生长水平。然而在实际操作中，受相互作用强度的影响，两板间菌落生长量的差异可能在 10% 至 60% 之间，这属于正常现象。切勿仅因存在此类差异而轻易排除潜在的阳性克隆。

最关键的结果判读依据在于菌落生长的相对趋势是否一致。 只要生长趋势符合预期（例如，在更严苛的 QDO/X/A 平板上生长略弱但仍显著），结果通常就是可靠的。当然，准确判断这种趋势需要一定的专业知识与实践经验。如果您对结果存疑，欢迎随时委托我们为您分析研判。

序列分析是金标准（但也别大意）：

①先看融合对不对： 拿到阳性克隆，务必测序！ 重点看插入片段是不是和GAL4 AD融合成了一个完整的开放阅读框（ORF）。别光看个开头就完事！
②数据库比对： 把这ORF序列扔到GenBank、EMBL这些数据库里比比，看是个啥基因。注意！ 很多文库克隆会带点3‘非翻译区（UTR）的尾巴，一定要仔细检查整个序列，找到真正编码蛋白并和AD融合的那部分。

报告基因激活不全 ≠ 假阳性（重要！）：

大部分真阳性会把所有报告基因都激活（又长又蓝）。但是！ 有时候你会碰到克隆在QDO上能长（说明激活了HIS3/ADE2），但就是不变蓝（说明没激活MEL1/LacZ）。这时候别急着扔！ 这不一定就是假阳性！可能这个猎物蛋白有点“挑食”，或者它的结构让它不好接近某个报告基因的启动子（UAS）。遇到这种情况，强烈建议用其他独立的方法（比如GST pull down+BiFC）再验证一下互作。别让假阴性漏网了！

酵母的“容错”机制与验证：

①移码和错读框： 酵母耐受翻译移码。有时候测序发现是个错误的阅读框，但它里面可能藏了个大ORF，而且这个错误框表达出来的蛋白居然还能相互作用！为了确认真假，最好把这插入片段重新克隆到正确的阅读框里，然后再看四个报告基因能不能都激活。 这是最靠谱的验证。
②测序只看到小短肽？继续测！ 如果测序结果显示融合的AD后面就跟着个小于10个氨基酸的小短肽，或者干脆没融合肽段？千万别停！继续往下测，冲过终止密码子！ 很可能后面藏着一个真正的、更大的ORF。这种情况经常发生在mRNA的5‘ UTR部分被连文库时一起克隆进去了，中间有个“空档”。用Gal4-AD抗体做个Western Blot（蛋白印迹）是绝招！ 它能直接告诉你AD融合蛋白到底存不存在、有多大，一清二楚。
③通读现象： 还有一种少见但存在的情况：两个不同的ORF连在一起（中间可能有非翻译区），酵母有时会“通读”过去，把两个都表达了并且都和AD融合了。这个Western Blot也能帮你看出端倪（蛋白大小异常）。

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