酵母单杂交（Y1H）技术作为解析DNA-蛋白“对话”的金标准之一，它尽管原理清晰，但实操中诱饵设计的精准性、AbA抑制浓度的严苛标定、庞大文库的转化效率、以及假阳性克隆的层层剔除（初筛、复筛、回转验证、点板验证），任何一个环节的细微偏差都可能导致结果天差地别。本文我们将结合钟鼎生物“5+8”质控体系下的实战案例，深度拆解酵母单杂交筛库（pABAi体系）全流程中的关键质控节点与成功要素，从诱饵构建验证到最终阳性互作确认，提升筛库的可靠性与效率。

单杂筛选（pABAi）5大步骤+8个结论

一、诱饵验证

为避免因序列差异造成对后期实验结果的影响，需要对原始克隆pAbAi-XXXX 进行测序和比对析。将测序结果与提供的参考序列进行比对，结果表明序列一致。

结论1：诱饵克隆 pAbAi-XXXX 序列正确，可继续进行后续实验。

二、诱饵线性化及整合 Y1H 鉴定

使用 BstbI 限制性内切酶将 4 µg pAbAi-XXXX 重组质粒线性化，参照以下酶切体系：

试剂	体积
pAbAi-XXXX 质粒	2 µg
10×Buffer	5 µl
BstbI	1 µl
ddH2O	Up to 50 µl

图1. pAbAi-XXXX酶切，左1酶切前，左2酶切后

注：所用marker为DL10000,从上到下条带依次为10000bp,7000bp,4000bp,2000bp,1000bp, 500bp,250bp

结论2：由图1可知：pAbAi-XXXX线性化成功，可以进行整合实验。

整合实验步骤如下：

2.1、将1 μg线性化pAbAi-XXXX整合到Y1HGold菌株中，涂布SD/-Ura平板，培养3-5天；

2.2、挑选4-5个SD/-Ura板上的单克隆，进行鉴定。通过电泳，确定插入条带大小是否正确，即载体是否正确整合到酵母基因组中，鉴定正确的克隆可以进行保菌。

整合鉴定结果：

图2.线性化pAbAi-MRXX整合Y1HGold后PCR鉴定

注：1、正确条带大小为：394 bp+ insert size。

2、所用marker为DL10000,从上到下条带依次为10000bp，7000bp，4000bp，2000bp，1000bp，500bp，250bp。

结论3：pAbAi-XXXX诱饵质粒正确整合到Y1H菌株里面，可以进行自激活检测实验。

三、自激活检测

3.1 从SD/-Ura平板上挑取Y1HGold[pAbAi-XXXX]单菌落，用0.9% NaCl溶液重悬，使得OD600为0.002；

3.2 涂布100 μl菌液于以下培养基：

SD/-Ura with AbA (0 ng/ml)	SD/-Ura with AbA (100 ng/ml)
SD/-Ura with AbA (150 ng/ml)	SD/-Ura with AbA (200 ng/ml)
SD/-Ura with AbA (300 ng/ml)	SD/-Ura with AbA (500 ng/ml)
SD/-Ura with AbA (700 ng/ml)	SD/-Ura with AbA (900 ng/ml)

3.3 根据菌落生长情况，选择最终筛选浓度用于后续筛库实验。如果AbA浓度调整到900 ng/ml仍然不能抑制生长，则该诱饵基因不适用于Y1HGold酵母单杂体系。

自激活检测图片：

图3. pAbAi-XXXX不同AbA浓度梯度下生长情况

结论4：由图3可知，Y1HGold[pAbAi-XXXX]在SD/-Ura平板上正常生长，但在SD/-Ura with AbA（200ng/ml）平板上没有生长，所以pAbAi-XXXX有轻微自激活可以进行后续筛选实验，空载体发生强烈自激活反应，阴性对照无自激活效应。

四、文库筛选

4.1、Y1HGold[pAbAi-XXXX]酵母菌株在SD/-Ura固体培养基上划线，30℃倒置培养2-3天；
4.2、挑取直径2-3 mm的单克隆3 ml YPDA培养液中，30℃，250 rpm摇床培养8 h；
4.3、吸取2-5 μl至50 ml YPDA中（250 ml三角瓶），30℃，23-250 rpm摇床培养16-20 h，直至OD600达到0.15-0.3；
4.4、将菌液平均分到两个50 ml的离心管中，室温，700×g，5 min，去除上清，用新鲜的100 ml培养液重新悬浮菌体，30℃，230-250 rpm，培养3-5 h，至OD600值为0.4-0.5；
4.5、室温700×g离心5 min以收集菌体，倒去上清并用60 ml无菌去离子水重悬酵母；
4.6、室温700×g离心5 min以收集菌体，倒去上清并用3 ml 1.1×TE/LiAc溶液重悬酵母；同时将Carrier DNA预变性两次；
4.7、高速离心15 s，去除上清，加入600 μl 1.1×TE/LiAC溶液吹打均匀；（备用）
4.8、取步骤7中酵母重悬液600 μl，在菌液中加入35 μl预变性的Carrier DNA，10ug Prey质粒，轻轻混匀；
4.9、加入2500 μl 1×TE/LiAc/PEG，混匀；
4.10、30℃水浴45 min，每15min摇匀一次；
4.11、每管加入160 μl DMSO，轻轻混匀；
4.12、42℃水浴热激20 min，每10 min上下颠倒混匀一次；
4.13、高速离心15 s，弃上清。用1 ml YPD Plus重悬菌体，30℃，250 rpm复苏1 h；
4.14、高速离心15 s，弃上清；
4.15、100 μl NaCl(0.9％)重悬菌体，涂布于SD/-Leu、SD/-Leu with AbA (300ng/ml)平板上；
4.16、30℃培养箱培养3-5天。预计有阳性克隆长出。

一、初筛部分图片：

图4 初筛SD/-Leu with AbA（300ng/ml）

结论5：初筛结果，由于在200ng/ml AbA不能抑制背景菌落，使用SD/-Leu with AbA（300ng/ml）平板进行筛选，初筛筛选到96个克隆。

二、为了避免假阳性，将初筛克隆点板到SD/-Leu with AbA（300ng/ml）平板，进行二次筛选，二次筛选图片：

图4 初筛SD/-Leu with AbA（300ng/ml）

注：数字编号红色表示无明显生长

结论6：复筛由图5得知：二次筛选后有3个克隆无明显生长即无互作，所以得到93个阳性克隆。

五、阳性克隆测序

将二次筛选平板上生长的93个阳性克隆进行菌落PCR测序，得到93个测序结果，进行NCBI比对。

结论7：回转验证
本次筛选初筛筛选到96个克隆，经过二次筛选得到93个阳性克隆，将93个阳性克隆全部分离AD质粒进行回转验证，6号、46号和64号无互作，去除重复本次筛选共得到84个阳性基因。

结论8：点板验证
点板验证和回转验证结果一致。（可依据文章需求，进行个性化展示）

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