这是SPR最基本的应用，回答的问题也最简单：这两个分子，到底有没有结合？

在药物发现的早期阶段，这种“初筛”策略的价值在于：快速将“完全不沾边”的分子剔除出去，把“有苗头”的分子捞出来，送入后续验证通道。这个工作在药企内部完成度较高。这边有一个经典案例值得一看：

图A筛选条件设置(Filter Dialogue)

• 图A 筛选条件设置：数据分析的门槛设置。设定只显示“校正后最大响应值在0-60RU之间”的传感图。通过设置筛选阈值，快速过滤掉信号过低或过高的数据点。


图B 结果汇总表格(Overview of all1512compounds)

• 图B 结果汇总表格：一个可排序的表格，列出了所有1512个符合筛选条件的化合物，包括其ID、浓度、分子量、校正后最大响应值(RU值)等。表格默认按RU值从高到低排序，挑出信号高的候选分子。


图C 代表性传感图叠加(Detailed view of sensorgrams)

• 图C 代表性传感图叠加：从图B中选中的四个化合物的单浓度传感图叠加显示。通过观察传感图的结合相和解离相形态，初步判断候选分子的动力学轮廓。


图D散点图(Scatter plot of response values)

• 图D 散点图：横轴是实验周期/样品序号，纵轴是结合响应值(RU)。一眼就能看到所有样品的信号分布，那些高高翘起的点就是潜在的“hit”。

如果说定性检测是“有没有”，那亲和力回答的就是“有多强”。

SPR给出的亲和力数值叫作KD，即平衡解离常数。单位是摩尔浓度（M），数值越小，亲和力越高。KD=1 nM，意思是只需要1纳摩尔的配体浓度，就能让一半的受体被占据——结合极为牢固；KD=1 μM，则需要1000倍以上的浓度才能达到同样的效果。在KD这个浓度上，整个体系处于动态解离与再结合的平衡之中，宏观上看，恰好是50%结合、50%游离。

这是SPR最广泛的应用场景。绝大部分朋友说“做个SPR”，指的就是测亲和力。

📊 举个例子

以下是Genedata Screener软件分析SPR浓度梯度实验(多浓度滴定)的用户界面截图。它展示的是对单个化合物进行多浓度梯度进样后，同时进行稳态亲和力拟合和动力学拟合。亲和力测定的实验中，可以用动力学拟合和稳态拟合两种数据处理分析方法。

KD告诉我们“结合得有多紧”，却不告诉我们“结合得有多快”和“松得有多快”。这两个信息，正是动力学。

SPR的传感图本质上是一张“结合-解离”的实时录像。分析物注入时曲线上升——这叫结合相，反映的是结合速率(ka)。换成缓冲液冲洗时曲线下降——这叫解离相，反映的是解离速率(kd)。

🧪 举个例子

实验目的：表征一组抗Basigin单克隆抗体的结合特性。SPR测定：将抗原固定在芯片上，让不同浓度的抗体流过，记录完整的结合和解离过程。结果显示，不同抗体的kd值从10⁻⁴到10⁻¹ s⁻¹不等，说明解离速率差异很大，这直接影响药物在体内的作用时间。

这个能力在抗体药物研发中尤为关键，回答的问题是：两个不同的抗体，识别的是抗原上的同一个区域吗？

如果两个抗体瞄准的是同一表位，它们会“互相抢座”，无法同时结合；如果识别的是不同区域，则二者可以和平共处，同时结合在抗原上。实验操作：将抗原固定在芯片上，先注入第一个抗体使其饱和结合，然后直接注入第二个抗体——注意，中间不洗脱——观察信号是否继续上升。信号上升，说明第二个抗体结合到了新的位点；信号不动，说明二者在争夺同一个位置。

🔬 举个例子

一眼即明，通过结合信号，非常清楚地区分mAb1与mAb2两个抗体blockers和non-blockers两种状态。

如果说前面的应用都是在看“结合”，那IC50测定看的是“阻断”——这个药物能在多大程度上拆散一对已知的互作分子？

实验逻辑：将靶点固定在芯片上，把固定浓度的互作蛋白与梯度浓度的待测药物预先混合，然后进样。随着药物浓度升高，互作蛋白的结合信号逐级下降。信号下降一半时对应的药物浓度，就是IC50。这是药物活性评价中最核心的指标之一。

💊 有个案例

研究者用这个方法测定了小分子化合物抑制AT-hook与dsDNA结合的IC50。

这个能力回答的核心问题是：我的样品里，真正“有功能的”分子占多少？

传统的蛋白浓度测定方法(如BCA、A₂₈₀)只能测总蛋白量，分不清“活的”和“死的”。样品里可能混了失活的蛋白、降解片段、聚集体——它们都算“蛋白”，但都是废的。

SPR通过对比已知活性的标准品，可以直接测出“能跟靶点结合的活性分子浓度”。这在生物药的质量控制中非常重要——批与批之间的活性浓度是否一致，直接决定了药效是否稳定。应用比较多的是校准-自由浓度分析(CFCA)的SPR方法。这个方法的核心特点就是不需要标准品做标准曲线，直接测定样品中“有活性”的蛋白浓度。

📈 有个案例

让“分子扩散到芯片表面”这个物理过程成为结合反应的限速步骤。通过分析两种不同流速下的结合曲线，就能直接算出能与配体结合的活性分子浓度，结果显示，活性浓度仅为总浓度的17.82%。这说明超过80%的蛋白虽然是“蛋白”，但已经失去了与靶点结合的功能。

前面的应用大多关注两个分子之间的互动，而这一场景则更进一步，回答两个问题：两个分子能否同时结合同一个靶点？一个分子结合之后，会不会改变靶点对另一个分子的亲和力？

实验采用连续进样：固定靶点，注入第一个分子，待其结合达到平衡后不洗脱，直接注入第二个分子。如果信号继续上升——说明第二个分子结合了新的位点，三元复合物成功形成。如果信号停滞——说明两个分子在竞争同一个结合位点。如果信号强度发生增强或减弱——说明第一个分子的结合改变了靶点的构象，从而影响了第二个分子的结合行为，这便是协同效应。

🧬 举个例子

将E3泛素连接酶(VHL)固定在芯片上，先注入PROTAC分子(MZ1)测定二元亲和力；然后，在芯片上先形成饱和浓度的目标蛋白brd4与PROTAC的复合物，再注入该复合物，测定三元复合物的亲和力。结果显示，Brd4的参与，让亲和力从29nM增加到1nM。这种实验结论的科学性比那些依靠WB条带粗细变化要靠谱得多。