Southern Blot，是分子生物学中"经典中的经典"。印迹杂交能检测通过凝胶电泳分离的混合样本中特定的DNA分子，其原理是通过吸水纸隔着凝胶和膜吸取水时产生的毛细管作用，将DNA分子从凝胶转移到多孔膜上，DNA分子与被标记的核酸探针在膜上杂交而被检测。本文详细介绍了 Southern Blot 印迹杂交的完整实验操作方法，从限制酶消化 DNA 到放射性检测，完整呈现经典 Southern Blot protocol，供大家参考。
- Southern Blot 实验流程总览
- 实验材料与试剂清单
- 限制酶消化 DNA（2-24h）
- 琼脂糖凝胶电泳（1-16h）
- 转膜前准备（2-3h）
- 转膜装置搭建与转膜
- DNA 固定与预杂交杂交
- 放射性检测与结果分析
- 常见问题解答（FAQ）
Southern Blot 实验操作简单，应用广泛，是分子学实验中必备的一项实验技术。完整的实验流程包括：限制酶消化 DNA → 琼脂糖凝胶电泳 → 转膜前准备 → 转膜装置搭建 → DNA 固定 → 预杂交与杂交 → 放射性检测。
2-24h
1-16h
中和2-3h
3-20h
预杂交+杂交
1-48h
- 电泳缓冲液：TAE 或 TBE
- 电泳级琼脂糖
- 溴化乙锭：0.5μg/ml，水溶解（或其他DNA染色试剂，如SYBR绿色）
- 2×和20×SSC：20×SSC 是 3.0 M 氯化钠，0.3 M 柠檬酸钠
- 6×loading buffer：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯苯胺 FF 和 30% 的甘油
- DNA marker
- 预杂交及杂交液：6×SSC，0.5% SDS，5×Denhardt 溶液和 100mg/ml 变性液
- Denhardt 溶液：0.02% 聚乙烯吡咯烷酮，0.02% Ficoll 和 0.02% 牛血清白蛋白（BSA）
- 硝酸纤维素或硝化纤维素过滤器
- 核糖核酸酶 A：2×20 pg/ml SSC
- 限制酶和缓冲液
- 放射性标记 RNA
- 2,5-二苯氧唑（PPO）：溶解于甲苯（20% wt/vol；仅用于检测用 ³H、³⁵S、¹²⁵I 或 ¹⁴C 标记的 RNA）
- 倒胶的胶槽及梳
- 电泳槽
- 适用于从窄条胶中转膜的设置（图1）：3片玻璃或有机玻璃（5cm×20cm，厚度与凝胶相同）、4或5块厚的干燥滤纸或平板纸（10cm×18cm）、由有机玻璃制成的杂交容器
- 适用于从宽凝胶中转膜的设置（图2）：四条窄的有机玻璃（厚度与凝胶相同，围绕成一圈并与凝胶边缘相距3mm）、深20-50mm的托盘（比凝胶长20mm，宽20mm）、一块玻璃片、几张比凝胶更大的厚滤纸、一块硝化纤维膜、一叠平板纸
试剂配制：DNA 应该先使用一组不同酶消化的 DNA 及不同的 DNA 浓度进行以下实验，以确定最佳 DNA 浓度和限制酶。通常，即使对于低拷贝数的样本（例如，质粒或噬菌体 DNA），PCR 获得 1μg 的 DNA 就足够了。当要分离更复杂的 DNA（例如，基因组 DNA）时，需要的 DNA 至少是 5-10μg。
电泳缓冲液：用 TAE（40 mM Tris，20 mM 乙酸，1 mM EDTA，pH 7.4-8.2，通常制成 20×浓度保存）或 TBE（89 mM Tris，2.5 mM EDTA，89 mM 硼酸盐，通常以 10×的浓度保存）。当凝胶跑胶时间较短，并且要从凝胶中回收 DNA 片段时，使用 TAE 通常是最佳的选择。TBE 适合于跑胶时间超过 2h 时使用。
把 DNA 样本放在冰域上，用适量的限制酶进行酶切。用移液枪头轻轻搅拌均匀，避免泡沫。
| 试剂 | 用量 |
|---|---|
| DNA (1μg/μl) | 10 μl (10μg) |
| 10×buffer | 10 μl (1× final concentration) |
| ddH₂O | 75 μl |
| Enzyme (10U/μl) | 5 μl (50U) |
消化反应在 37°C（最好在水浴中）进行。对于 PCR 来源的 DNA，通常是 1-2h 足够了。对于基因组 DNA，通常需要消化过夜。为了避免酶"耗尽"，一半的酶可以在消化开始时添加，在消化过程中添加。对于长时间消化反应，另一半的酶可以在第二天早上添加，然后继续培养一个小时。
在消化后可能需要浓缩 DNA 到合适的体系，这样才能加到凝胶加样孔中。对于大多数标准凝胶加样孔而言，一般合适的上样体积是 20μl。当加入 6×loading buffer 时，每孔上样量会变成 24μl。
百分比取决于要分离的片段的大小。所需凝胶的大小取决于待分离的片段的范围，通常需要较长的凝胶以确保基因组 DNA 和相似大小的多个片段能充分分离。对于大多数应用，0.8-2% 的凝胶就足够了。对于 0.8% 以下的凝胶，可能需要在凝胶底部使用高百分比（例如 2%）的基础凝胶，因为低百分比的凝胶非常脆弱。
| Agarose in gel (percent) | Efficient range of separation of linear DNA (kb) |
|---|---|
| 0.3 | 60-5.0 |
| 0.6 | 20-1.0 |
| 0.7 | 10-0.8 |
| 0.9 | 7-0.5 |
| 1.2 | 6-0.4 |
| 1.5 | 3-0.2 |
| 2.0 | 2-0.1 |
通过在 ddH₂O 中稀释适量的储备溶液来补充 1×buffer。将合适量的琼脂糖加入锥形瓶中的 1×buffer 中，混匀，确保不形成团块。例如，配置 150ml 的 1.5% 琼脂糖凝胶时，将 2.25g 琼脂糖溶解在 150ml 1×buffer 中。在微波炉或加热搅拌器中将琼脂糖熔化。
将含有熔融凝胶的烧瓶转移到磁力搅拌器中。让凝胶缓慢冷却至约 50-60°C，同时轻轻地搅拌。如果需要在凝胶添加溴化乙锭，则应在此阶段添加，浓度为 0.5μg/ml。
在凝胶冷却的同时，准备足够的 1×buffer（如需含有溴化乙锭，浓度为 0.5μg/ml）以填充电泳槽。将 buffer 倒入槽中，使其比凝胶载体高几毫米。
准备制凝模型，选择合适的制胶梳子。确保凝胶浇铸（梳子就位）在水平表面上，并缓慢倒入凝胶。
凝胶凝固后（此时外观呈乳白色），轻轻取下梳子。将凝胶转移到电泳槽中，加入 1×running buffer 以覆盖凝胶。添加 loading buffer 至 DNA 样品中（对于 6×原液，每 5μl 样品加入 1μl loading buffer）。用移液管尖端轻轻搅拌混合，避免产生气泡。
如果凝胶在不存在溴化乙锭的情况下进行，则将凝胶浸泡在含有溴化乙锭（0.5μg/ml）的电泳缓冲液中 0.5-2h。
将凝胶小心地转移到连有相机的透照仪上。在相机上使用红色滤光片拍摄紫外线下（256nm；高浓度 DNA 也可在 302 或 356nm 处检测）的凝胶。在凝胶旁放置一把尺子（这有助于将 DNA 的荧光照片与杂交后的最终放射自显影相匹配）。PCR 的 DNA 样本应该显示为不同的条带；基因组 DNA 应该显示为涂片，具有代表重复 DNA 元件的更亮条带。
如果要转移大片段，可将凝胶浸入稀酸（例如 0.2M HCl 中 10min）中以诱导脱嘌呤。通过将凝胶完全浸入 1.5M NaCl，0.5M NaOH 中 15-30min，使凝胶变性，此步骤最好在托盘中不停摇晃进行。
用 3M NaCl，0.5M Tris-HCl（pH7）替换 1.5M NaCl，0.5M NaOH 溶液，再放置 15-30min，这一步是中和凝胶。
转膜流程视频演示
对于窄条带的转膜（如图1所示），准备用于转膜的组件，以便有一片厚的滤纸（20cm×18cm）浸泡在 20×SSC 中和一片硝酸纤维素滤膜（与凝胶的长度相当，宽约 1cm）浸泡在 2×SSC 中。
按照图1或图2所示搭建转膜装置。将硝酸纤维素膜放在凝胶顶部，使其边缘放在有机玻璃或玻璃板上，使其桥接在两块玻璃上。在凝胶与膜接触之前，请小心对齐，并通过从一个边缘缓慢向下贴，避免在凝胶和膜之间出现空气。
转膜设置垂直放置，完成转膜所需的最短时间取决于片段的大小和凝胶浓度。例如，3 小时足以让所有 HaeIII（来自大肠杆菌 DNA 片段）完全从 3mm 厚的 2% 琼脂糖凝胶转移出去。但从 9mm 厚的凝胶转移小鼠大的 EcoRI 片段，即使 20h 也完成不了。
在转膜结束后，小心地提起硝酸纤维素膜，使凝胶保持附着在其下侧。翻转硝酸纤维素膜并通过用铅笔画一系列点来标记凝胶的轮廓。从硝酸纤维素上剥离凝胶。用火焰刀片切割硝酸纤维素，使得与凝胶接触的区域保持不变。
将膜浸入 2×SSC 中 10-20min。将膜在 80°C 的真空烘箱中烘烤 2 小时。或者，DNA 可以通过暴露于短波长紫外光而与膜交联。
在容器中的杂交，将膜放置在少量的闭合液中。对于 1cm×18cm 的膜，需要约 1ml 的溶液。使膜杂交适当的时间。杂交的时间取决于 RNA 浓度、其序列复杂性、纯度和杂交条件，但通常大于 1h。离开过夜是可以的，这对于大多数探针来说足够长。
在适当的时间后，从溶液中取出膜，并将它们在滤纸之间进行印迹。在杂交温度下，在大量杂交溶剂中，在搅拌下洗涤膜 20-30 分钟。使用辐射监测器检查背景。如果背景高，则在 20°C 下用 RNase 溶液处理 30 分钟。用 2×SSC 冲洗膜。膜自然晾干。
洗膜流程视频演示
杂交流程视频演示
（ii）将膜放在 X 射线胶片上并用轻微压力将其压平。
（ii）膜在空气中自然干燥。
（iii）将膜置于 X 射线胶片上并保持在 -70°C。
检测放射性 RNA，使用方法 A 检测 ³²P 标记的 RNA 和方法 B 检测 ³H、³⁵S、¹²⁵I 或 ¹⁴C 标记 RNA。
检测时间：1-48h，取决于杂交产量和探针比活性。方法 A 操作简单，适合 ³²P 标记的高能放射性探针；方法 B 需要荧光照相增强，适合低能放射性探针。选择合适的检测方法可以显著提高检测灵敏度。
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