项目	信息
文献标题	Licochalcone C suppresses gastric cancer progression and enhances 5-FU chemosensitivity by targeting RAC3-mediated PI3K-AKT-mTOR signaling
文献译名	甘草查尔酮C通过靶向RAC3介导的PI3K-AKT-mTOR信号抑制胃癌进展并增强5-氟尿嘧啶化疗敏感性
期刊名称	Phytomedicine
影响因子	11.3
第一作者	王清水
通讯作者	林尧、黄铭涵、薛芳沁
单位	福建中医药大学

研究背景

胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤和第三大癌症死因。系统化疗是晚期胃癌的主要治疗手段，其中5-氟尿嘧啶（5-FU）是一线方案的核心药物，但耐药问题严重制约疗效。天然产物是抗肿瘤药物的重要来源，甘草中的查尔酮类化合物（如甘草查尔酮A、B、C等）已被报道具有广谱抗癌活性。其中，甘草查尔酮A可通过抑制药物外排泵（P-gp、BCRP）增强化疗敏感性，并在胃癌中与5-FU协同增效。然而，结构相似的甘草查尔酮C在胃癌中的抗肿瘤作用及其对5-FU敏感性的影响尚不清楚。本研究旨在系统评估甘草查尔酮C的抗胃癌活性及其增敏5-FU的潜力，并阐明其分子靶点和信号通路，为克服胃癌化疗耐药提供新策略。钟鼎生物协助完成了生物素标记甘草查尔酮C pull-down联合质谱的工作，为该项目提供了充分的技术支持。

作者研究的核心是揭示了天然产物甘草查尔酮C通过靶向RAC3蛋白，从“抑制药物外排（下调P-gp）”和“阻滞细胞周期（诱导G1期阻滞）”两个层面协同增强胃癌对5-FU的化疗敏感性。而小分子pull-down实验在其中起到了“一锤定音”的决定性作用——它从成千上万种蛋白中直接“钓”出了RAC3，证实了甘草查尔酮C与RAC3存在直接物理结合，从而将整个机制链条的起点牢牢锚定在RAC3这个靶点上，为后续所有信号通路和增敏效应的研究奠定根基。

研究思路

1.功能表型分析与通路定位

Licochalcone C处理胃癌细胞系（AGS、MKN45）及患者来源类器官，CCK-8、克隆形成、Transwell迁移/侵袭实验证实其显著抑制增殖、迁移和侵袭；RNA-seq结合Western blot及流式细胞术揭示其诱导G1期阻滞（Cyclin D1/CDK2/CDK4下调）并抑制PI3K-AKT-mTOR磷酸化。

2.靶点发现与验证—小分子pull-down + 质谱及功能救援

生物素标记Licochalcone C pull-down联合质谱鉴定RAC3为直接结合靶点，分子对接、CETSA、Co-IP验证其物理结合，G-LISA证实其抑制RAC3 GTPase活性但不改变表达量；shRNA敲低RAC3表型复制Licochalcone C的抗肿瘤效应，RAC3过表达逆转上述效应，证实RAC3为其关键功能性靶点。

3.增敏机制解析与临床转化验证

① RAC3敲低或Licochalcone C处理下调P-gp表达（Western blot），降低5-FU外排；
② 抑制PI3K-AKT-mTOR通路诱导G1期阻滞——双通路协同增强5-FU敏感性（IC50显著下降）；
③TCGA及GEO数据库联合IHC（80例临床样本）验证RAC3在胃癌中高表达且与不良预后及化疗复发正相关；④裸鼠移植瘤模型证实Licochalcone C联合5-FU体内抑瘤效果最强（体积/重量最小、Ki67最低）。

主要研究发现

1. 甘草查尔酮C在体外和患者来源类器官中抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭

CCK-8实验显示，甘草查尔酮C剂量依赖性地降低AGS和MKN45细胞活力，IC50分别为18.02 μM和11.6 μM（图1A-B）。克隆形成实验表明其显著减少集落数量（图1E），Transwell迁移和侵袭实验证实其抑制细胞迁移和侵袭能力（图1F-I）。在患者来源的胃癌类器官中，甘草查尔酮C同样剂量依赖性地抑制类器官生长，IC50值明确（图1J-M），代表性图像显示类器官尺寸显著缩小（图1N）。上述结果表明甘草查尔酮C具有广谱抗胃癌活性。

图1.甘草查尔酮C对胃癌细胞生长、运动和类器官的影响。

2. 转录组分析揭示甘草查尔酮C诱导G1期阻滞并抑制PI3K-AKT-mTOR信号

RNA-seq分析显示，甘草查尔酮C处理后的下调基因显著富集于细胞周期和PI3K-AKT通路（图2B），上调基因富集于代谢通路（图2C）。流式细胞术证实其诱导G1期阻滞（图2D），Western blot显示Cyclin D1、CDK2、CDK4蛋白水平下调（图2E-F）。同时，PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平显著受抑（图2G-H），在类器官中亦得到验证（图2I），免疫荧光进一步显示p-AKT和p-mTOR表达降低（图2J-K）。这些结果表明甘草查尔酮C通过阻断G1/S转换和抑制PI3K-AKT-mTOR通路发挥抗肿瘤作用。

图2.甘草查尔酮C处理后的细胞周期和PI3K-AKT-mTOR信号传导分析。

3. 甘草查尔酮C直接靶向RAC3并抑制其活性，但不改变其蛋白表达

为寻找直接靶点，研究者合成生物素标记的甘草查尔酮C，进行pull-down联合质谱分析（图3A），鉴定出多个候选蛋白，其中RAC3因已知可激活PI3K-AKT通路而被重点关注（图3B）。分子对接预测甘草查尔酮C与RAC3具有良好的结合亲和力（图3C-D）。CETSA实验表明，甘草查尔酮C处理增强RAC3的热稳定性（图3E-F），Co-IP证实生物素-甘草查尔酮C可结合内源性RAC3（图3G-H）。然而，甘草查尔酮C并不改变RAC3蛋白表达水平（图3I），但显著降低RAC3的GTPase活性（G-LISA实验，图3J），IC50分别为36.7 μM（AGS）和23.6 μM（MKN45）。综上，甘草查尔酮C是RAC3的直接抑制剂，通过结合RAC3抑制其功能而非下调其表达。

图3.甘草查尔酮C的RAC3靶点验证

4. RAC3功能调控胃癌细胞进展及PI3K-AKT-mTOR信号，并介导甘草查尔酮C的表型效应

构建RAC3敲低（shRNA）模型后，细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭均显著受抑（图4C-H），而RAC3过表达则增强这些恶性表型（图4K-O），且过表达可逆转甘草查尔酮C的抑制作用（补充图2）。机制上，RAC3敲低下调Cyclin D1/CDK2/CDK4并抑制PI3K/AKT/mTOR磷酸化（图4P-U），而过表达则相反（图4V-W）。这些结果证实RAC3是甘草查尔酮C发挥抗肿瘤效应的功能性靶点。

图4、RAC3相关的细胞表型和PI3K-AKT-mTOR信号传导。

5. 临床分析显示RAC3在胃癌中过表达且与不良预后相关，RAC3敲低通过下调P-gp增强5-FU敏感性

TCGA和GSE66229数据集显示RAC3 mRNA在胃癌组织中显著高于正常组织（图5A-B）。三个独立GEO队列（GSE29272、GSE15459、GSE183136）的Kaplan-Meier分析表明高RAC3表达与较差总生存显著相关（图5C-E），TCGA中亦提示更差的特异性生存（图5F）。IHC验证了RAC3蛋白在胃癌组织中高表达，且与晚期临床分期正相关（图5G-K）。重要的是，RAC3敲低后，5-FU的IC50显著降低（图5N-O），同时P-gp（MDR1编码）蛋白表达下调，而MRP1/MRP2无明显变化（图5P-Q）。临床标本中，辅助化疗后复发患者的RAC3表达显著高于无复发生存者（图5L-M）。这些结果表明RAC3过表达是化疗耐药和不良预后的标志物，且RAC3通过上调P-gp介导耐药。

图5、RAC3表达、预后及5-FU敏感性分析。

6. 甘草查尔酮C下调P-gp并增强5-FU在细胞、类器官及体内的敏感性

Western blot证实甘草查尔酮C处理显著降低P-gp表达（图6C），与RAC3敲低表型一致。在细胞系中，甘草查尔酮C联合5-FU使5-FU的IC50显著下降（图6A-B）。在患者来源类器官中，联合处理亦显著降低IC50（图6D-E）。体内裸鼠移植瘤模型中，单独使用甘草查尔酮C（低/高剂量）或5-FU均能抑制肿瘤生长，而联合治疗组（低剂量甘草查尔酮C+5-FU）显示出最强的抑瘤效应，表现为肿瘤体积最小、重量最轻（图6F-I），且Ki67增殖指数最低（图6J）。该体内实验证实甘草查尔酮C既能单药抗癌，又能有效增敏5-FU化疗。

图6、甘草查尔酮C和5-FU在胃癌模型中的反应。

整体机制模型

基于上述发现，研究者提出了甘草查尔酮C增强5-FU化疗敏感性的双重协同机制：

第一重：抑制RAC3-PI3K-AKT-mTOR-P-gp轴（直接增敏）

甘草查尔酮C直接结合RAC3并抑制其GTPase活性 → 阻断RAC3介导的PI3K-AKT-mTOR信号激活 → 下调P-gp（药物外排泵）表达 → 减少5-FU外排，增加胞内药物累积，增强细胞毒性。

第二重：抑制RAC3-细胞周期进程（协同增效）

甘草查尔酮C抑制RAC3后，PI3K-AKT-mTOR通路受抑 → 下调Cyclin D1/CDK2/CDK4 → 诱导G1期阻滞 → 减缓肿瘤细胞增殖，使更多细胞处于5-FU敏感周期（S期），从而增强5-FU的杀伤效应。

两条通路共同作用：一方面提高5-FU胞内浓度，另一方面使细胞更易受药物攻击，两者协同显著抑制胃癌进展。该研究首次揭示RAC3作为胃癌化疗敏感性调控的关键节点，并将甘草查尔酮C定位为靶向RAC3的天然增敏剂，为临床联合治疗提供了坚实的理论基础和实验依据。

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