RNA pull-down 是检测目的RNA结合蛋白质的核心技术之一。它通过将已知序列的RNA标记并固定在珠子上，从细胞裂解物中富集与之结合的蛋白质，再通过Western Blot或质谱鉴定。本文系统介绍RNA pull-down的实验原理、两种研究基本思路，以及高碘酸盐耦联法、生物素-磁珠耦联法和免疫沉淀法（RIP）的详细实验流程，供大家参考。
- RNA pull-down原理
- 基本思路：两种研究策略
- 策略一：RNA耦联珠子——高碘酸盐耦联法
- 策略一：RNA耦联珠子——生物素-磁珠耦联法
- 策略二：免疫沉淀蛋白富集RNA（RIP）
- 常见问题解答（FAQ）
RNA沉降（Pull down）主要是检测蛋白质与RNA之间的相互作用。首先把已知序列的RNA做好标记（例如biotin），依靠这个标记将RNA固定到某珠子（Beads）上，再和含有蛋白质的物质，例如细胞裂解物共孵育，之后去掉未与RNA作用的上清。收集从珠子上洗下来的蛋白质，如果蛋白质是未知的，则要去作质谱鉴定；如果想知道是不是某蛋白质，则要作Western Blot鉴定。
核心逻辑：已知RNA序列 → 标记并固定在珠子上 → 与细胞裂解物孵育 → 洗去未结合蛋白 → 收集结合蛋白 → Western Blot鉴定已知蛋白 / 质谱鉴定未知蛋白。
视频讲解
研究蛋白质与RNA之间的相互作用，大致有两种思路：
适合已知RNA找蛋白的场景。通过生物素标记或高碘酸盐耦联，将目标RNA固定在珠子上，从裂解物中捕获结合蛋白。
适合已知蛋白找RNA的场景（即RIP实验）。通过特异性抗体富集目标蛋白，再提取与之结合的RNA，利用QT-PCR等方法检测。
①RNA-高碘酸盐反应
500 pmol RNA（100个碱基的RNA 15 μg，25个碱基的RNA 4 μg）；40 μL 1 mol/L CH3COONa pH=5.0；20 μL 0.1 mol/L高碘酸盐（溶于水且新鲜配制）；补水至400 μL。
室温，置于旋转仪上孵育1 h（反应管外包铝箔纸）。
加80 μL 1 mol/L CH3COONa（pH=5.0），再加1 mL 100%无水乙醇，-20℃，静置1 h。在此期间，开始准备珠子。
4℃，12000 r/min，10 min，70%乙醇洗一次后干燥；将干燥好的RNA沉淀用100 μL CH3COONa（0.1 mol/L）重悬。
②准备珠子
将100 μL乙二酸去异烟肼琼脂糖珠（含50%上清）在10 mL离心管中洗涤，10 mL 0.1 mol/L CH3COONa（pH 5.0）洗3次，每次4℃，3000 r/min，5 min，弃上清。
用200 μL 0.1 mol/L CH3COONa（pH=5.0）重悬样品。
③RNA-珠子结合反应
将之前准备好的300 μL珠子加入高碘酸盐处理好的RNA中。
4℃置于旋转仪上避光结合过夜（反应管外包裹铝箔纸）。
4℃，3000 r/min，5 min，去上清，用1 mL 2 mol/L NaCl洗2次，然后将样品移至1.5 mL EP管，4℃，3000 r/min，5 min，弃上清。
④接下来，可选方案1或方案2。
a. 洗RNA结合的珠子
- 用1 mL缓冲液D洗3次，4℃，3000 r/min，5 min，弃上清。
- 100 μL缓冲液D重悬。
| HEPES | 40 μL |
| KCl | 2 mL |
| EDTA | 4 μL |
| DTT | 20 μL |
| 甘油 | 1.2 mL |
| 酶抑制剂 | 20 μL |
b. RNA-Protein结合反应
300 μL缓冲液D；100 μL目的蛋白（10-15 μg/μL）；肝素（100 μg/μL储存液稀释至终浓度0.5-2.5~5.0 μg/μL）；加酶抑制剂，按1:1000加；补水至500 μL。
摇晃混匀。旋转仪上孵育4 h（4℃）。
4℃，3000 r/min，5 min，尽可能弃去上清。1 mL缓冲液D洗3次，每次置于旋转仪上5 min，去上清。
加入50 μL 2×SDS上样缓冲液，煮样10 min，行Western Blot。
a. 洗RNA结合的Beads
- 用1.0 mL缓冲液B，4℃ 3000 r/min，5 min，弃上清。
- 100 μL缓冲液B重悬。
| HEPES | 5 mmol/L |
| MgCl2 | 1 mmol/L |
| 乙酸镁 | 0.8 mmol/L |
b. RNA-蛋白质结合反应
50 μL 10×结合缓冲液；100 μL目的蛋白（10-15 μg/μL）；100 μL结合了RNA的珠子；肝素（100 μg/μL储存液稀释至终浓度0.5-2.5~5.0 μg/μL）；加酶抑制剂，按1:1000加；补水至500 μL。
轻轻摇晃离心管，于旋转仪上孵育30 min，室温。
4℃，3000 r/min，5 min，尽可能弃去未结合的蛋白混合物。Buffer B洗5次（1 mL），4℃，3000 r/min，5 min，弃上清。
加入50 μL 2×SDS上样缓冲液，煮样，行Western Blot。
方案选择建议：方案1使用缓冲液D，适合大多数常规RNA-蛋白结合实验；方案2使用缓冲液B（低离子强度），结合时间更短（30 min），适合结合动力学较快或结合较弱的RNA-蛋白互作。
（1）实验原理
使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链酶亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
核心优势：生物素-链霉亲和素结合是目前已知最强的非共价相互作用之一（Kd ~10-15 M），结合速度快、特异性高，且链霉亲和素磁珠封闭充分、背景低，是目前RNA pull-down最常用的方法。
（2）需要的试剂
亮抑酶酞，抑酶酞，胃酶抑素，HEPES等。
（3）实验步骤
100 mm培养皿（6×106细胞），去培养基 → PBS洗2次 → 沉淀用0.5 mL胰蛋白酶消化，加入PBS 2 mL，反复吹打收集细胞，转移至EP管，3000 r/min离心2 min，弃上清，PBS重复洗1次。加入100 μL缓冲液A，吸打混匀，冰浴15 min。加入缓冲液A（含2.5% NP40）12.5 μL，轻缓颠倒混匀6次，4℃，4000 r/min离心5 min，上清用于胞浆蛋白分析。
Promega试剂盒，Maxiscript T7 Kit，#1312。
a. 205 mmol/L NTP Mix。
b. 体外转录反应。
c. 探针纯化。
a. 珠子处理。
b. Pull-down。
c. 煮样，行Western Blot。
当研究目标是"某个已知蛋白结合了哪些RNA"时，就需要采用免疫沉淀策略（RIP）。
6盘10 cm皿已经长满的细胞。
DEPC处理的PBS洗3遍，10 mL/遍。最后用4 mL PBS刮下细胞，并将细胞吹散。
将细胞转移至5 mL离心管中，2000 r/min离心5 min，弃上清。
加入2 mL（根据细胞量确定）免疫共沉淀缓冲液，吹匀细胞。冰上裂解20~30 min，期间用1 mL枪和2.5 mL注射器将细胞裂解液吹散，使反应充分进行。
将细胞裂解液转移至2个2 mL EP管中，12000 r/min最高转速离心20 min，离心后取上清。
取100 μL珠子于1.5 mL EP管中。用免疫共沉淀buffer洗3遍，再加入100 μL免疫共沉淀缓冲液，将珠子均匀悬浮其中。
将准备好的beads与第(5)步中的上清混合，4℃旋转1 h。
离心后，吸出液体，将液体平均分到2个EP管中，分别加入4 μg抗体和Normal IgG，并都加入2 μL RNase抑制剂，混匀，4℃，旋转过夜。
准备100 μL珠子，方法同(6)，加入5 μL RNase抑制剂（可选）。
将(9)中的珠子每管加入26 μL。4℃反应1.5 h。
用免疫共沉淀缓冲液洗珠子，洗5遍。
Trizol提取RNA，用于后续QT-PCR或测序检测。
RIP关键控制点：①全程使用DEPC处理耗材和RNase抑制剂，防止RNA降解；②设置Normal IgG对照，排除非特异性结合；③预清除步骤不可省略，可显著降低背景；④抗体用量需根据抗体效价优化，一般1-4 μg/反应。
猜您想看：
- RNA pull down案例解析：看看我们是怎么做的。
- RNA pull down常见问题：如何防止RNA降解？结合亲和力低如何解决？条带背景深什么原因。
- 体外转录合成RNA案例解析：来看看体外转录法合成RNA是如何做的。
相关服务
联系我们
 |
南京栖霞区红枫科技园A6栋2层 |
 |
E-mail：order@zoonbio.com |
 |
技术热线电话: 400-066-8086 |
 |
025-85634800 025-85454800 025-85774800 025-84448440 |