RIP-qPCR案例解析

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RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 结合蛋白免疫沉淀)是研究RNA-蛋白质相互作用的重要工具,可以揭示RNA和蛋白质之间的功能关系、调控机制以及在疾病发生和发展中的作用。主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化对结合在复合物上的RNA 进行qPCR验证或者测序分析。本实验的实验对象为癌细胞,利用重组Anti-YB1抗体,得到与其相关的基因的信息。

试剂耗材和仪器
试剂 仪器
RNA Binding Protein Immunoprecipitation Kit 各型号tip,离心管
重组Anti-YB1抗体 台式微量高速离心机
TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent 移液器
Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 荧光定量聚合酶链反应检测系统
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix 雪花状制冰机
SDS 蛋白电泳仪、蛋白电泳槽
其它试剂均为国产分析纯 精骐捷美试管旋转混合器

实验方法

1、准备405μL Complete RIP Lysis Buffer。

2、收集2x107个细胞样品,加入2mL PBS洗涤细胞,离心后弃上清收集细胞沉淀,预留1/4的细胞样品用于后续Input组的RNA提取及纯化(使用无核酸酶的EP管存放,-80℃保存)。

3、向剩余细胞沉淀中加入400μL Complete RIP Lysis Buffer重悬,并用移液枪吹打混匀10次,使细胞充分裂解,冰浴30min,每5min涡旋一次,10s/次,裂解后用超声破碎仪冰浴超声5min,20%的功率,超声3s,间歇3s。4℃,12000rpm离心10min,取上清,记为Lysis,并按照150μL(IP)、150μL(IgG)、100μL(Input)分成三份,Input样品-80℃保存备用。

4、准备2支1.5mL EP管,分别标记IgG管和IP管,将ProteinA/G Magnetic Beads管上下颠倒10次,待磁珠和液体混匀后,分别取出30μL到IgG管和IP管。

5、每管加入300μL RIP Wash Buffer,用移液枪吹打混匀5次,置于磁力架上静置1min,弃上清,该步骤操作3次。

6、用300μL的RIP Wash Buffer重悬磁珠。

7、IP管加入3-5μg目的抗体,IgG管加入3-5μg目的抗体相同宿主的IgG,放到静音混合器上室温孵育2h。

8、将两管放到磁力架上静置1min,弃上清。

9、加入300μL RIP Wash Buffer,用移液枪吹打混匀5次,在磁力架上静置1min,弃上清,该步骤操作3次。

10、准备1.8mL RIP Buffe,向步骤4.3所得的IgG管和IP管中分别加入900μL RIP Buffer,150μL步骤3所得Lysis,放到静音混合器上,4℃孵育过夜。

11、将两管放到磁力架上静置1min,弃上清。

12、将两管各加入300μL RIP Wash Buffer,用移液枪吹打混匀5次,在磁力架上静置1min,弃上清,该步骤操作5次。

13、将两管各加入300μL RIP Wash Buffer,用移液枪吹打混匀5次,取100μL混合液到新管,标记为①管,剩余液体记为②管,将4管置于磁力架上静置1min,弃上清,①管加100μL Elution Buffer,煮沸10min后磁力架上静置1min,取上清到新管,加入5X Loading buffer混匀准备WB检测,②管用于纯化RNA,分组设置见下表:

组别 RIP Wash Buffer 命名 体积 用途
IgG 300μL IgG-① 100μL WB
IgG-② 200μL RNA纯化
IP 300μL IP-① 100μL WB
IP-② 200μL RNA纯化

14、步骤2预留的Input样品和IgG-②管、IP-②管各加入500μL的Trizol,涡旋混匀,室温静置5min,再加入100μL的氯仿,涡旋混匀,4℃,12000rpm离心10min,取上层水相(约300μL)到新管,做好标记。

15、加入50μL Salt Solution,550μL异丙醇混匀,-80℃静置2-4h,使用前放置4℃解冻。

16、4℃,12000rpm离心10min,弃上清。

17、加入500μL 75%乙醇,4℃,12000rpm离心10min,小心弃掉上清,该步骤操作3次。

18、开盖室温晾干,加10-20μL DEPC H2O,移液枪吹打,使RNA完全溶解,-80℃保存备用。

19、按照逆转录试剂盒进行操作后qPCR分析目的基因。对目标富集集合区域进行分析并设计荧光定量引物,分别以Input产物,IP产物和IgG产物为模板进行扩增。


实验结果

1、Western blot检测蛋白

表1 一抗以及二抗稀释比例
Table 1 The dilution ratio of primary antibody and second antibody

编号 抗体名称 稀释比例 二抗名称 稀释比例
1 重组Anti-YB1抗体 1:1000 鼠抗兔 1:10000

对样本进行第一轮WB检测:

rip案例

图1 western blot蛋白检测
Fig.1 western blot Protein detection
Lane M:PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
(从上到下:250,130,100,70,55,35,25,15,10)


RIP WB检测:

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图2 western blot蛋白检测
Fig.2 western blot Protein detection
Lane M:PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
(从上到下:250,130,100,70,55,35,25,15,10)
Lane 1:IP
Lane 2:IgG
Lane 3:Input

RIP WB轻链抗体检测:

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图3 western blot蛋白检测
Fig.3 western blot Protein detection
Lane M:PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
(从上到下:250,130,100,70,55,35,25,15,10)
Lane 1:Input
Lane 2:IP
Lane 3:IgG

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图4 western blot蛋白检测
Fig.4 western blot Protein detection
Lane M:PageRuler? Plus 预染蛋白分子量标准
(从上到下:250,130,100,70,55,35,25,15,10)
Lane 1:Input
Lane 2:IP
Lane 3:IgG


2、RIP-qPCR结果

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