RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）是研究RNA-蛋白质相互作用的重要工具，可以揭示RNA和蛋白质之间的功能关系、调控机制以及在疾病发生和发展中的作用。主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化对结合在复合物上的RNA 进行qPCR验证或者测序分析。本实验的实验对象为癌细胞，利用重组Anti-YB1抗体，得到与其相关的基因的信息。

试剂耗材和仪器
试剂	仪器
RNA Binding Protein Immunoprecipitation Kit	各型号tip，离心管
重组Anti-YB1抗体	台式微量高速离心机
TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent	移液器
Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR	荧光定量聚合酶链反应检测系统
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix	雪花状制冰机
SDS	蛋白电泳仪、蛋白电泳槽
其它试剂均为国产分析纯	精骐捷美试管旋转混合器

实验方法

1、准备405μL Complete RIP Lysis Buffer。

2、收集2x107个细胞样品，加入2mL PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀，预留1/4的细胞样品用于后续Input组的RNA提取及纯化（使用无核酸酶的EP管存放，-80℃保存）。

3、向剩余细胞沉淀中加入400μL Complete RIP Lysis Buffer重悬，并用移液枪吹打混匀10次，使细胞充分裂解，冰浴30min，每5min涡旋一次，10s/次，裂解后用超声破碎仪冰浴超声5min，20%的功率，超声3s，间歇3s。4℃，12000rpm离心10min，取上清，记为Lysis，并按照150μL（IP）、150μL（IgG）、100μL（Input）分成三份，Input样品-80℃保存备用。

4、准备2支1.5mL EP管，分别标记IgG管和IP管，将ProteinA/G Magnetic Beads管上下颠倒10次，待磁珠和液体混匀后，分别取出30μL到IgG管和IP管。

5、每管加入300μL RIP Wash Buffer，用移液枪吹打混匀5次，置于磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作3次。

6、用300μL的RIP Wash Buffer重悬磁珠。

7、IP管加入3-5μg目的抗体，IgG管加入3-5μg目的抗体相同宿主的IgG，放到静音混合器上室温孵育2h。

8、将两管放到磁力架上静置1min，弃上清。

9、加入300μL RIP Wash Buffer，用移液枪吹打混匀5次，在磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作3次。

10、准备1.8mL RIP Buffe，向步骤4.3所得的IgG管和IP管中分别加入900μL RIP Buffer，150μL步骤3所得Lysis，放到静音混合器上，4℃孵育过夜。

11、将两管放到磁力架上静置1min，弃上清。

12、将两管各加入300μL RIP Wash Buffer，用移液枪吹打混匀5次，在磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作5次。

13、将两管各加入300μL RIP Wash Buffer，用移液枪吹打混匀5次，取100μL混合液到新管，标记为①管，剩余液体记为②管，将4管置于磁力架上静置1min，弃上清，①管加100μL Elution Buffer，煮沸10min后磁力架上静置1min，取上清到新管，加入5X Loading buffer混匀准备WB检测，②管用于纯化RNA，分组设置见下表：

组别	RIP Wash Buffer	命名	体积	用途
IgG	300μL	IgG-①	100μL	WB
		IgG-②	200μL	RNA纯化
IP	300μL	IP-①	100μL	WB
		IP-②	200μL	RNA纯化

14、步骤2预留的Input样品和IgG-②管、IP-②管各加入500μL的Trizol，涡旋混匀，室温静置5min，再加入100μL的氯仿，涡旋混匀，4℃，12000rpm离心10min，取上层水相（约300μL）到新管，做好标记。

15、加入50μL Salt Solution，550μL异丙醇混匀，-80℃静置2-4h，使用前放置4℃解冻。

16、4℃，12000rpm离心10min，弃上清。

17、加入500μL 75%乙醇，4℃，12000rpm离心10min，小心弃掉上清，该步骤操作3次。

18、开盖室温晾干，加10-20μL DEPC H2O，移液枪吹打，使RNA完全溶解，-80℃保存备用。

19、按照逆转录试剂盒进行操作后qPCR分析目的基因。对目标富集集合区域进行分析并设计荧光定量引物，分别以Input产物，IP产物和IgG产物为模板进行扩增。

实验结果

1、Western blot检测蛋白

表1 一抗以及二抗稀释比例
Table 1 The dilution ratio of primary antibody and second antibody

编号	抗体名称	稀释比例	二抗名称	稀释比例
1	重组Anti-YB1抗体	1：1000	鼠抗兔	1:10000

对样本进行第一轮WB检测：

图1 western blot蛋白检测
Fig.1 western blot Protein detection
Lane M：PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
（从上到下：250，130，100，70，55，35，25，15，10）

RIP WB检测：

图2 western blot蛋白检测
Fig.2 western blot Protein detection
Lane M：PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
（从上到下：250，130，100，70，55，35，25，15，10）
Lane 1：IP
Lane 2：IgG
Lane 3：Input

RIP WB轻链抗体检测：

图3 western blot蛋白检测
Fig.3 western blot Protein detection
Lane M：PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
（从上到下：250，130，100，70，55，35，25，15，10）
Lane 1：Input
Lane 2：IP
Lane 3：IgG

图4 western blot蛋白检测
Fig.4 western blot Protein detection
Lane M：PageRuler? Plus 预染蛋白分子量标准
（从上到下：250，130，100，70，55，35，25，15，10）
Lane 1：Input
Lane 2：IP
Lane 3：IgG

2、RIP-qPCR结果

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