免纯化MST banner

分子互作，蛋白纯化是第一道坎，也是最大的一道坎。挂标签、上柱、洗脱、浓缩……顺利两三天，不顺利两三个星期，折腾一两个月连一条条带都拿不到。
膜蛋白 提出来就析出，去垢剂不合适就聚集；转录因子 表达量低，纯化一轮所剩无几；有些蛋白一挂标签活性就消失……纯化过不去，互作实验就得停。
但问题是——纯化真的是互作实验的前提条件吗？

一、免纯化MST

传统互作方法里，SPR需要纯化蛋白固定在芯片上，ITC需要两边都是纯净物。但MST不太一样——它检测的是荧光分子在温度梯度中的迁移，背景里的杂蛋白、脂质、细胞碎片不发光，不干扰信号。它不要求样本是纯的，但是需要互作的一方有荧光标签，所以有一条经典路径就是构建荧光GFP融合蛋白，然后做MST。

免纯化mst步骤图

经典操作流程

  1. 第一步：构建融合蛋白表达体系 —— 构建蛋白-GFP融合质粒，转染哺乳动物细胞，裂解提取，离心取上清，得到含蛋白-GFP的粗提液（含杂蛋白、脂质、碎片，但GFP信号可被MST识别）。
  2. 第二步：Pretest —— 用Assay Buffer（含0.05% Tween-20的PBST）稀释蛋白-GFP裂解液至工作浓度（5-150 nM），上机检测荧光强度、有无吸附或聚集。关键质控
  3. 第三步：Binding Check —— 配体与蛋白-GFP混合，设空白对照，检测信噪比（Signal-to-Noise Ratio > 5 数据可信）。
  4. 第四步：Binding Affinity —— 配体2倍梯度稀释（16个浓度点），加入固定浓度蛋白-GFP，DMSO终浓度≤5%，避免影响活性。
  5. 第五步：上机检测与拟合 —— 室温避光孵育15 min，毛细管上样，MST自动记录荧光变化，软件拟合结合曲线，直接计算Kd值。典型倒“S”形曲线表示特异性结合。

二、相关文献 · 权威验证

1.The phytochemical hyperforin triggers thermogenesis in adipose tissue via a Dlat-AMPK signaling axis to curb obesity（IF=27.7）

上海交通大学附属第六人民医院刘军力团队验证植物化合物金丝桃素（Hyperforin, HPF） 与靶蛋白Dlat的直接结合，将Dlat与GFP融合表达（Dlat-GFP），转染HEK293T细胞后直接制备裂解液，以其中的Dlat-GFP融合蛋白作为荧光信号分子进行MST检测，成功测定了HPF与Dlat-GFP的亲和力（Kd = 578 nM），证明了Dlat是HPF的直接作用靶点。

mst文献案例图
2.Glutamate acts on acid-sensing ion channels to worsen ischaemic brain injury（Nature）

研究人员研究谷氨酸（Glutamate）?与酸敏感离子通道1a（ASIC1a）?的相互作用，构建ASIC1a-GFP融合质粒并转染HEK293T细胞，直接使用细胞裂解液进行MST实验，该研究揭示了谷氨酸通过增强ASIC电流加剧缺血性脑损伤的新机制，为中风治疗提供了新靶点。这说明MST技术在膜蛋白等难纯化蛋白研究中的优势。

mst文献案例图

三、案例展示

mst案例图
mst案例图
mst案例图

四、方法学优势

✅ 免纯化，省时省力

裂解液直接上机，避开纯化陷阱，节省数周时间。

✅ 保留天然构象

无标签干扰，GFP融合不影响蛋白互作活性。

✅ 膜蛋白/低表达适用

无需大量纯化蛋白，尤其适合难表达蛋白。

✅ 粗提物直接检测

杂蛋白不干扰荧光信号，背景干净。

✅ Kd值精准

拟合倒S曲线，特异性结合明确，数据可靠。

✅ 样本需求极少

微升级裂解液即可完成检测，珍贵样本适用。

五、常见问题FAQ

Q1: 构建GFP融合蛋白后，裂解液需要浓缩或换液吗？
A: 一般不需要。裂解液用Assay Buffer适当稀释至工作浓度（5-150 nM）即可直接上机。若裂解液中含有高浓度甘油或去垢剂，建议适当稀释或换液。
Q2: 如果蛋白没有GFP荧光，可以用其他荧光标签吗？
A: 可以。除GFP外，mCherry、YFP、CFP等荧光蛋白均可用于MST。也可通过荧光染料标记实现免纯化检测。
Q3: Pretest主要看哪些指标？
A: ①荧光强度是否在检测范围内（5-150 nM）；②毛细管中是否有聚集或沉淀；③毛细管壁是否有吸附。Pretest通过即表明样本适合MST。
Q4: 配体中的DMSO对实验有影响吗？
A: 配体母液通常含DMSO，但终浓度应≤5%（建议≤2%）。过高DMSO可能影响蛋白活性或荧光信号。使用含5% DMSO的Ligand Buffer进行梯度稀释，确保各浓度点DMSO一致。

六、技术交流

部分客户署名公司发表文章：

1.Targeting SCAMP2 by a natural product auxarconjugatin B for glioblastoma therapy via restoring aspartate metabolic flux.10.1016/j.apsb.2026.02.018 （IF=14.6）
2.Hypericin photoactivation induces triple-negative breast cancer cells pyroptosis by targeting the ROS/CALR/Caspase-3/GSDME pathway. （IF=11.3）
3.Argonaute 2 inhibits RIG-I signaling via competition for viral RNA bindin.10.1016/j.isci.2025.113391. （IF=4.6）
4.Concept of Targeted Drug Conjugate and Its Application in Reversing Drug Resistance.10.1021/acs.jmedchem.4c03006.（IF=6.872）
5.Targeting GRP75 with a Chlorpromazine Derivative Inhibits Endometrial Cancer Progression Through GRP75–IP3R-Ca2+-AMPK Axis.Adv. Sci. 2024, 11, 2304203(IF=14.3)
6.RPS4XL encoded by lnc-Rps4l inhibits hypoxia-induced pyroptosis by binding HSC70 glycosylation site.Received 18 July 2021; accepted 18 May 2022;(IF=10.183)
7.Berberine modulates microglial polarization by activating TYROBP in Alzheimer’s disease.Phytomedicine 135 (2024) 156237(IF=6.7)

七、MST热泳动检测相关服务

基因表型互作 分子互作技术专题
Biacore平台 SPR技术服务
Octet RED384系统 BLI分子互作
检测制备标记 抗体服务专题
建库筛库 酵母双杂交
凝胶/电泳迁移率实验 EMSA
细胞热转移分析 CETSA技术服务

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