双荧光素酶报告基因系统是探索启动子转录活性及miRNA靶基因作用的“顶流”工具。传统实验通常将载体转染至HEK293等真核细胞中进行观测，然而，当研究对象为细菌启动子、原核特异转录因子或抗生素响应元件时，真核细胞的内环境却可能成为干扰源——复杂的染色质结构、核膜隔离机制以及真核特有的翻译后修饰系统，不仅会引入高背景噪音，更可能模糊甚至扭曲这些原核元件在原核环境中本应展现的调控特性。

因此，将实验体系回归至大肠杆菌，成为关键一步。在这一真正“适配”的细胞环境中，细菌启动子及其他原核调控元件得以在其天然、进化适应的背景下发挥作用。大肠杆菌体系不仅排除了真核系统的结构性干扰，更能准确捕捉抗生素诱导、转录因子结合等原核调控行为的真实动态。接下来我们介绍一种大肠杆菌双荧光素酶系统，可以实现在原核胞内环境中对基因表达进行精准、定量的解析。

实验思路

1. 实验材料准备

①菌株：大肠杆菌 BL21
②报告载体（基于pETDuet-1骨架构建）：
测试载体1：pETDuet-1-T7-LUC-T7-RLUC（对照）
测试载体2：pETDuet-1-US-LUC-T7-RLUC（增强型启动子）
测试载体3：pETDuet-1-CSPA-LUC-T7-RLUC（减弱型启动子）

③培养基：LB/TB，含相应抗生素（如Kan、Amp）
④诱导剂：IPTG（终浓度0.3 mM）
⑤裂解液：1×PBS + PMSF（1:100）
⑥双荧光素酶报告基因检测试剂盒

2. 质粒转化及菌落培养

构建并合成双荧光素酶报告质粒。将构建完成的双荧光素酶报告质粒使转化至大肠杆菌表达菌株BL21，涂布平板，37℃培养过夜。PCR筛选阳性菌落。将阳性菌落重悬于已加入抗性的LB培养基中，37℃ 200 r/min，振荡过夜培养，保存菌种。

3. 蛋白表达

将试验菌种接入含有相应抗生素的LB培养基中，37℃，200 rpm 培养3 h。加入终浓度0.3 mM IPTG，37℃，200 rpm培养4 h，收集菌体。使用裂解液重悬菌泥，超声破碎1 min。离心，取裂解上清作为实验材料，液氮速冻后储存在-80℃备用。

4. 荧光检测

将试剂和样品于室温融化。取20 μL裂解上清作为反应样品加入96孔白色不透光酶标板中，每组（测试组、对照组、空白对照）各3个技术重复。在样品孔加入萤火虫萤光素酶检测工作液，混匀，室温孵育10 min，使用酶标仪测定发光值。再加入海肾萤光素酶检测工作液，混匀，室温孵育后，使用酶标仪测定发光值。

5. 数据分析

计算实验组比值、对照组比值及表达倍数。
背景：空菌；
对照组：对照质粒诱导表达样品；
测试组：测试质粒诱导表达样品。
实验组比值=(实验组 F-背景 F)/(实验组 R-背景 R)。
对照组比值=(对照组 F-背景 F)/(对照组 R-背景 R)。
表达倍数=实验组比值/对照组比值。

案例

本次实验将对照组中的LUC对应的启动子替换为测试组中的弱启动子，检测其荧光强度变化

	样本	LUC值	RLUC值	荧光比值 (LUC/RLUC)	均值
对照组	1	11999	496408.6667	0.024171617	0.024622084
	2	7476.333333	346356.3333	0.021585669
	3	12019	427586	0.028108965
测试组	1	419.6666667	410988	0.001021117	0.000998822
	2	551.3333333	549548	0.001003249
	3	581.6666667	598361	0.0009721

组别	平均相对荧光比值	标准差 (SD)	标准误 (SEM)
对照组	1	0.003284895	0.001896535
测试组	0.040566093	0.000024806	0.000014322

将LUC片段的启动子更换为弱启动子后检测相对荧光变化。从数据可以看出，更换启动子后，相对荧光明显减弱。可证明，构建的系统对于启动子变化是可检测的。

方法学优势

天然适配性
为细菌启动子、原核转录因子及抗生素响应元件提供其进化适应的“原生家园”，确保调控行为在真实的原核背景下进行。

排除干扰
规避真核细胞特有的复杂结构（如染色质、核膜）和修饰系统，最大限度减少背景噪音，获得更纯净、更真实的调控信号。

操作便捷高效
大肠杆菌培养周期短、遗传操作成熟、转化和诱导表达流程标准化，显著提升实验效率。

成本效益高
相比真核细胞培养，所需试剂和耗材成本更低。

应用

1. 合成生物学元件库的定量表征
在合成生物学中，构建功能可预测的遗传元件库（如启动子库、核糖体结合位点库、终止子库等）是核心任务。本系统可作为高通量定量表征平台，精确测量不同元件对基因表达的影响，为构建数学模型和设计基因线路提供关键的、标准化的实验数据。

2. 环境信号感应与信号转导通路解析
可将待研究的信号感应元件（如转录因子结合位点、核糖开关、双组分系统等）与报告基因LUC相连。通过监测在不同环境刺激（如代谢物浓度、渗透压、pH、抗生素压力等）下荧光素酶活性的变化，从而精确解析细胞内的信号转导通路，鉴定关键调控因子及其作用机制。

3. 药物筛选与抗菌剂效价评估
针对以细菌为靶点的药物研发，可以将药物的作用靶点（如特定的启动子或调控序列）整合到报告系统中。当药物作用于靶点时，会引起报告基因表达水平的改变。该系统可用于高通量筛选抗菌先导化合物，或实时评估抗生素的抑制效果及细菌的耐药性发展，为新型抗菌药物的研发提供有力工具。

4. 蛋白质-相互作用间接研究
虽然不直接检测相互作用，但可通过将假设受相互作用的调控序列（如被特定转录因子激活或抑制的启动子）与报告基因相连。通过共表达或干扰潜在的相互作用蛋白，观察报告信号的变化，从而间接推断蛋白质-DNA、蛋白质-蛋白质之间的相互作用关系及其对转录的调控效应。

文献分享

Measurement of the Promoter Activity in Escherichia coli by Using a Luciferase Reporter

这篇文献介绍了一种在大肠杆菌K-12中使用细菌荧光素酶（lux）报告系统高通量测量启动子活性的详细实验方案。该方法的核心在于将待研究的启动子序列克隆到一个不含自身启动子的luxCDABE报告基因操纵子（pLUX载体）上游，从而构建一个报告质粒。当该质粒被转入大肠杆菌后，目标启动子的活性会直接驱动整个lux操纵子的表达，其产物不仅能催化生物发光反应，还能自行合成反应底物，因此无需裂解细胞即可通过化学发光仪直接、灵敏地检测到发光信号，实现了对体内基因表达动态的便捷、低成本和高通量分析。

图1.pLUX报告质粒构建策略。

图2.荧光素酶报告揭示了大肠杆菌中H-NS对18个启动子的沉默。

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