DNA-SIP 稳定同位素核酸探针技术服务
【图 1】DNA-SIP 技术路线概览一、技术原理
DNA-SIP 的检测对象是新合成的 DNA，因此它反映的是哪些微生物在活跃生长并同化了标记底物，而不涉及蛋白与底物的结合。这一机制带来了不依赖抗体、不依赖培养、可直接对接测序的优势，也划出了边界：不复制或复制极慢的微生物即使代谢活跃，也可能不被标记，所需孵育时间通常长于 RNA-SIP。
在密度梯度中，标记 DNA 的浮力密度升高幅度与同位素掺入量相关，但 DNA 浮力密度并不只由同位素决定。基因组 G+C 含量本身就会带来约 1.69–1.73 g·mL-1 的密度跨度，高 GC 的未标记 DNA 也可能落在偏重层。CsCl 密度梯度与 G+C 含量的经验式是 ρ = 0.098[G+C] + 1.66，这也是判读时必须设置对照的底层原因。
二、服务流程与质控节点
DNA-SIP 的常规流程分为孵育、离心、测序三个环节，但实际项目中影响数据质量的，往往是孵育时间、标记底物浓度、CsCl 梯度折光率、分层收集精度这几个容易被忽略的节点。钟鼎生物在每段流程上都设了对应的质控动作，下面按节点拆开说明。
① 标记孵育：先做预实验再定终点
底物浓度过高可能引入非目标碳源或渗透胁迫，过低则标记掺入不足。孵育时间是交叉喂养风险的主要调节变量，我们会建议设置短、中、长三个时间节点做预实验，而不是直接跑单一终点。
② 总 DNA 提取：兼顾完整性、纯度与产量
土壤样品的腐殖酸残留会干扰 qPCR 和测序，DNA 片段过短会影响密度梯度分层锐度。提取环节需要同时看产量、纯度和片段分布，不能只追产量。
③ CsCl 密度梯度离心：折光率是核心质控指标
超高速离心理想折光率通常控制在 nD-TC 1.4029 ± 0.0002，对应浮力密度约 1.725 g·mL-1。温度波动会改变 CsCl 密度剖面，导致条带漂移，离心过程需严格控温。
④ 分层收集与密度测定
通常收集十余层至二十层，逐层测定折光率并换算浮力密度。分层数量不足会降低重层与轻层的分辨率，直接影响“错峰”判读的灵敏度。
⑤ qPCR 判读与测序层选择
先比较处理组与对照组各层的基因拷贝数分布，确认峰层迁移后再选层测序。仅凭处理组某层“有 DNA”不能作为标记成功的依据，这是钟鼎生物在交付报告里会明确标出的一步。
三、怎样判定标记成功
判读的主要依据，是处理组与未标记对照组在同一浮力密度区间内的丰度分布差异。当处理组的 qPCR 峰或测序丰度峰向更高浮力密度方向迁移，而对照组对应层没有同步升高，才构成标记成功的证据。
我们在交付时会同时给出各层浮力密度、处理组与对照组 qPCR 拷贝数曲线、峰层偏移量（ΔBD），以及用于测序的层位选择依据。这些数据比单张凝胶图更能支撑结论的可重复性，也方便后续写文章时直接引用。
【图 2】处理组与对照组 qPCR 浮力密度分布对比四、实验设计中需要提前规避的三个问题
DNA-SIP 的结果需要结合对照和梯度数据综合判断，并不能仅凭标记直接定论。下面三个问题如果不在实验设计阶段提前管理，很容易产生过度归属或假阳性功能类群。
① 交叉喂养（cross-feeding）
初级利用者代谢产生的含标记副产物被其他微生物二次利用，导致非直接利用者也被标记。孵育时间越长、底物越易代谢，风险越高。对策包括缩短孵育、设置时间序列、降低底物浓度，并结合对照与丰度梯度判断标记来源。
② 标记阈值与灵敏度
通常需要 15–20 atom% 以上的标记掺入，才能在 CsCl 梯度中形成可分辨的密度位移。DNA-SIP 依赖细胞复制，比 RNA-SIP 灵敏度低、所需时间更长；对于复制缓慢的类群，可能需要延长孵育，或改用 RNA-SIP、PLFA-SIP 做交叉验证。
③ 基因组 G+C 含量干扰
高 GC 基因组的未标记 DNA 天然浮力密度偏高，可能被误判为“重层标记 DNA”。必须通过未标记对照、GC 偏差校正和分层密度精确测定来排除这一干扰，不能仅凭密度阈值切层。
五、主要应用场景
DNA-SIP 可以把一个可操作的底物和一群可测序的微生物对应起来。下面三类场景是它最能发挥判别力的方向，也是钟鼎生物积累项目经验较多的方向。
特定碳/氮底物的活性利用者鉴定
例如凋落物碳、根系分泌物碳、甲烷、甲醇、铵、硝酸盐等底物的同化微生物鉴定。DNA-SIP 可以区分群落里存在与在本次条件下真正活跃利用该底物的类群，这是 16S 扩增子单独做不到的。
根际碳氮耦合中的功能类群归属
根际是植物—微生物碳氮互作的热点。DNA-SIP 可追踪根际沉积碳进入哪些微生物类群，也可结合 15N 标记解析固氮、硝化、反硝化相关功能菌群。近期研究还将 DNA-SIP 与随机森林、结构方程模型联用，解析根际碳氮协同驱动多环芳烃降解的群落组装机制。
有机污染物降解功能微生物的鉴定
用 13C 标记目标污染物，直接追踪哪些微生物将其同化进入 DNA。这一策略在多环芳烃、有机磷农药等污染物降解菌筛选中已有应用，可与宏基因组联合获取降解基因和通路信息。
六、从标记 DNA 到功能结论：我们的下游分析方案
DNA-SIP 本身的输出是分层的、带密度标签的 DNA 材料，后续能回答什么问题，取决于选哪一层 DNA、用哪种测序策略。钟鼎生物把下游分析按客户要解决的问题拆成四档，可以按课题深度单独选择，也可以直接打包全流程。
| 下游技术 | 能回答什么 | 与 DNA-SIP 的衔接要点 |
|---|---|---|
| qPCR / 定量 | 标记是否成功、峰层是否迁移 | 处理组与对照组必须同批跑，比较各层拷贝数分布，而不是单看重层有无信号 |
| 16S/18S 扩增子测序 | 重层富集的微生物“是谁” | 选层依据来自 qPCR 错峰结果，需同时测轻层和对照层做背景扣除 |
| 功能基因扩增子 | 标记类群携带哪些关键功能基因 | 如 pmoA、nirS/nirK、PAH-RHDα 等，可验证底物代谢与功能类群的对应关系 |
| 宏基因组 / MAGs | 功能潜力、代谢通路与基因组归属 | 从重层 DNA 构建宏基因组，可绕过培养获得功能类群基因组草图，需要足够的标记 DNA 量 |
七、为什么选择钟鼎生物
同位素标记与分子检测同一平台完成
标记孵育方案设计、CsCl 密度梯度离心、qPCR 判读、测序和宏基因组分析都在钟鼎生物内部完成，不用在几家单位之间转样，减少样本损耗和周期不可控的问题。
与土壤碳氮同位素检测业务协同
钟鼎生物本身提供氨基酸、木质素酚、磷脂脂肪酸同位素检测及微生物 CUE、NUE、CAE 指标，DNA-SIP 可以和这些检测打包设计，从“谁在利用”延伸到“利用效率多少”，让课题的数据链更完整。
判读标准写进交付报告
我们不会只给一张重层凝胶图就结束。报告里会同时呈现各层浮力密度、处理组与对照组 qPCR 错峰曲线、峰层偏移量和选层依据，方便审稿人直接核对，也方便客户后续复现。
对交叉喂养和 GC 干扰有成熟处理经验
在孵育时间设计、标记底物浓度梯度、对照设置和分层密度校正上，我们有一套经过项目验证的流程，能在实验设计阶段就把假阳性风险压下去，而不是等数据出来再解释。
下游多组学衔接顺畅
DNA-SIP 重层 DNA 可直接进入 16S/18S 扩增子、功能基因扩增子或宏基因组 / MAGs 流程，钟鼎生物有对应的测序与生信分析团队，避免“标记做完了，下游分析找不到人接”的尴尬。
可按课题深度灵活组合
可以只做标记与 qPCR 判读，也可以做全流程“标记—测序—宏基因组—同位素效率指标”。预算有限时先做关键层验证，后续再扩展，不会被固定套餐绑死。
八、常见问题
Q1：DNA-SIP 和 RNA-SIP 怎么选？
DNA-SIP 灵敏度较低、孵育时间较长，但 DNA 更稳定、下游可做功能基因和宏基因组分析，适合追踪复制活跃、长期响应的功能类群；RNA-SIP 标记速度快、灵敏度高，更适合捕捉短时间内的转录活性变化。两者不是替代关系，对关键结论建议交叉验证。
Q2：为什么一定要做未标记对照组？
因为 DNA 浮力密度受基因组 G+C 含量、GC 偏差和梯度质量多重影响，高 GC 的未标记 DNA 也可能出现在偏重层。只有与未标记对照比对、确认处理组峰层向更高密度迁移，才能把“重层有带”和“标记成功”区分开。
Q3：交叉喂养会导致假阳性吗？如何降低风险？
会。交叉喂养让非直接利用者获得标记，如果仅凭重层测序结果归属功能，可能高估初级利用者的范围。降低风险的主要手段包括：缩短孵育时间、设置时间序列、降低标记底物浓度，以及用对照和丰度梯度辅助判断标记来源。
Q4：13C 标记需要达到多少才能分离？
通常要求标记掺入达到 15–20 atom% 以上，才能在 CsCl 梯度中形成可分辨的浮力密度位移。低于该阈值时，标记 DNA 与轻层 DNA 的密度差异过小，分层收集难以有效区分。
Q5：土壤样品可以做 DNA-SIP 吗？
可以。DNA-SIP 已广泛应用于土壤、根际、沉积物、水体、生物膜和污水处理系统等环境介质。土壤样品的难点主要在于腐殖酸去除、DNA 提取效率和本底微生物量较高，需要在提取和孵育设计阶段做针对性优化，这些钟鼎生物都有对应方案。