在药物靶点发现的探索中，SM Pull Down、ABPP 等策略常通过将小分子药物改造成带有标记的探针，借助荧光成像或亲和富集来捕获靶蛋白。这类化学标记方法虽然应用广泛，却面临两道天然门槛：一是部分小分子结构复杂，难以在不破坏活性的前提下实现有效标记；二是引入标签后，分子的极性、构象及溶解度等理化性质往往随之改变，可能导致结合信号失真，甚至催生假阳性结果。正是基于此，无需对药物进行任何修饰的非标记鉴定技术，正成为补齐这一短板的重要途径。
钟鼎生物此前已依托药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）技术，为众多科研团队提供了非标记靶点鉴定服务。本文我们介绍另一种原理独立、同样无需标记的技术——细胞热转移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）。CETSA 通过定量检测药物结合后靶蛋白在活细胞内热稳定性的变化，实现了对胞内直接结合事件的无扰动测量。经过十余年的技术沉淀，CETSA 已被广泛视为活细胞层面靶点结合验证的“金标准”。CETSA与DARTS互为镜像，两者从"抗水解"和"抗热"两个维度共同验证靶点，使非标记靶点鉴定体系更加完善。
CETSA的核心逻辑简单而优雅：蛋白分子的空间结构在受热时容易“坍塌”变性，成为不可溶的聚集物。如果有一把小分子药物的“钥匙”精准地插入蛋白口袋，药物-蛋白复合物的结构会被“加固”，需要更高的温度才能让它“散架”。 具体而言，当小分子药物与靶蛋白结合后，会降低蛋白的自由能，使复合物的热稳定性显著高于游离蛋白。在随后进行的温度梯度实验中，未结合药物的游离蛋白在相对较低的温度下即发生热变性并沉淀析出，而药物-蛋白复合物则能在更高的温度下保持可溶构象。通过Western blotting或质谱技术，定量检测不同温度条件下溶液中剩余的可溶性蛋白含量，即可根据热熔解曲线的右移程度（即热转变中点Tm的升高），来证实药物与靶蛋白间的直接相互作用。
一、活细胞给药与药物原位结合
在细胞处于最适生长状态的培养体系中，加入待测小分子药物，另设DMSO溶剂对照组。37°C细胞培养箱中孵育适当时间（通常1-3小时，根据药物透膜性和作用动力学调整），让药物在活细胞内充分接触蛋白质组，完成构象变化和结合稳定化的过程。
二、温度梯度处理诱导蛋白热变性
消化收集细胞，PBS洗涤后等量分装至PCR管。设置温度梯度（如37°C至67°C，每间隔2-4°C设一个点），利用PCR仪对各管样品进行3分钟精确加热，随之室温冷却3分钟。在此过程中，未与药物结合的游离蛋白随温度升高逐步去折叠、暴露疏水核心并沉淀；药物结合蛋白则因构象更紧致而保持可溶。
三、裂解与可溶性蛋白分离
向各温度处理后的样品中加入含NP-40或温和去垢剂的裂解缓冲液。随后采用液氮反复冻融3次进行完全裂解，在4°C、20,000g条件下超速离心20-30分钟，将热变性聚集的蛋白沉淀与含可溶性活性蛋白的上清液彻底分离。
四、蛋白定量检测与数据分析
取上清液，进行BCA蛋白定量后开展Western blotting实验（针对单个靶点验证）。用靶蛋白特异性的一抗和相应二抗检测，通过化学发光成像记录不同温度下条带强度变化，再将数据输入软件，通过Boltzmann S形方程拟合热熔解曲线，比较药物组与对照组的Tm差值。
①无需化学修饰，保留药物本色：可直接使用纯天然结构的化合物进行实验，避免因添加生物素、荧光基团等标签而改变药物构效关系，从源头减少假阳性或假阴性。
②活细胞原位检测，信息更接近真实：药物可与完整的活细胞共同孵育，在接近生理的环境下完成靶点结合的检测，给出的结合信息更具生理意义和临床转化价值。
③应用覆盖药物开发全链条：从前期单一靶点的反向验证（CETSA-WB），到全蛋白质组的正向发现（CETSA-MS/TPP），再到高通量药物筛选（HT-CETSA）和体内组织靶点结合监测，CETSA均可作为核心技术方案。
④输出方式灵活，按需定制：既可以对目标蛋白进行精确定量（Western blotting模式），也可以与TMT标记定量质谱联用，在全蛋白质组范围无偏好地发现新靶点和脱靶蛋白。
1.Bruceine A protects nuclear receptor 4A1 from ubiquitin-degradation to alleviate mesangial proliferative glomerulonephritis（IF=52.7）
2025年12月，广州中医药大学第二附属医院潘胡丹/刘良院士团队与中国人民解放军总医院陈香美院士团队合作在 Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=52.7）上发表研究论文。该研究从公共数据中筛选出核受体NR4A1作为系膜增生性肾小球肾炎的关键靶点，并从中药鸦胆子中筛选到活性成分Bruceine A（BA）作为NR4A1的高亲和力分子。在靶点验证环节，研究团队利用CETSA-WB实验检测了BA与NR4A1在活细胞内的直接结合情况。实验方法为：将细胞经BA或对照处理后，在不同温度梯度下加热裂解，随后通过Western blot检测各温度下NR4A1蛋白的残留量。CETSA结果显示，BA处理组在更高温度下仍保留更多可溶性NR4A1蛋白，热熔解曲线明显右移。该结果明确证实BA在活细胞环境中能够直接结合并稳定NR4A1蛋白，且论文提供的CETSA-WB条带图和热熔解拟合曲线为靶点确认提供了坚实证据。
2.CETSA-MS-based target profiling of anti-aging natural compound quercetin（IF=10.4）
2024年， European Journal of Medicinal Chemistry（IF=10.4）上发表了一项关于槲皮素全蛋白质组靶点分析的研究。研究团队首先采用CETSA-MS策略，在全蛋白质组水平上筛选出37个热稳定性增强的蛋白和33个热稳定性降低的蛋白。随后，作者对其中的候选靶点进行了系统的CETSA-WB验证实验：通过Western blotting结合温度梯度处理，分别验证了槲皮素与CBR1蛋白（增强组）和MAPK1（降低组）的直接结合，并通过分子对接、定点突变和pull-down实验进行正交互证。该研究的一个亮点在于同时展示了CETSA-WB可检测到药物结合导致的不同热稳定性变化方向（正向和负向）。
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