载体选对了，BiFC 实验就成功了一半。双分子荧光互补（BiFC）技术是能直观、快速反应蛋白质在细胞内相互作用的常用方法。它的核心原理是利用荧光蛋白的两个部分再次组装形成完整荧光蛋白而发光——而承载这两个部分的载体，正是整个实验的关键。本文系统介绍 BiFC 载体的设计原理、哺乳表达体系载体、植物表达体系载体，以及载体选择的实操建议，供大家参考。
📋 本文内容速览
- BiFC 载体的设计原理：为什么需要两个片段
- 哺乳表达体系常用载体一览
- 植物表达体系常用载体一览
- 载体选择决策图：植物还是哺乳？
- 载体构建实操要点
- 常见问题解答（FAQ）
PART 01BiFC 载体的设计原理：为什么需要两个片段
构建于 BiFC 载体的荧光蛋白片段，是将荧光蛋白在某些特定的位点切开的，形成了不发光荧光的 2 个多肽，靠近 N 端的称为 N 片段（N-fragment），另一个是 C 片段（C-fragment）。
N 片段与 C 片段在细胞内共表达或体外混合时，不会自发靠近，相互结合成完整的荧光蛋白，需要借助与它们融合表达的蛋白间的相互作用，N 片段和 C 片段才能在空间上相互靠近互补。因此融合了由荧光蛋白 N 片段和 C 片段的载体模板是 BiFC 实验的关键。
N 端片段载体
- 表达荧光蛋白 N 端片段
- 融合目标蛋白 A
- 单独表达无荧光活性
C 端片段载体
- 表达荧光蛋白 C 端片段
- 融合目标蛋白 B
- 单独表达无荧光活性
图1 BiFC 载体的基本结构——N 片段载体与 C 片段载体
核心机制：BiFC 载体将荧光蛋白"一分为二"：N 片段载体融合蛋白 A，C 片段载体融合蛋白 B。只有当蛋白 A 和蛋白 B 发生相互作用时，N 片段和 C 片段才会被拉近并重新折叠，恢复荧光活性。没有互作，就没有荧光。
PART 02哺乳表达体系常用载体一览
1. pBiFC-VC155 与 pBiFC-VN173（常配套使用）
pBiFC-VC155 / pBiFC-VN173 参数对比
| 骨架质粒 | pBiFC-VC155：pCMV-HA | pBiFC-VN173：pFlag-CMV |
| 质粒用途 | BiFC 实验 |
| 质粒大小 | pBiFC-VC155：4088 bp | pBiFC-VN173：5216 bp |
| 载体标签 | pBiFC-VC155：HA | pBiFC-VN173：FLAG |
| 报告基因 | pBiFC-VC155：VC155 | pBiFC-VN173：Venus (1-172) |
| 5' 端测序引物 | CMV-F |
| 3' 端测序引物 | pBiFC-VC155：EBV-Rev | pBiFC-VN173：hGH-PA-R |
| 抗性基因 | Ampicillin |
图2 pBiFC-VC155 载体图谱
图3 pBiFC-VN173 载体图谱
2. pBiFC-VN155(I152L)
pBiFC-VN155(I152L) 参数
| 骨架质粒 | pMyc-CMV |
| 质粒用途 | BiFC 实验中可替代 pBiFC-VN173，与 pBiFC-VC155 配套使用 |
| 适用体系 | 哺乳动物细胞 |
| 质粒大小 | 4289 bp |
| 载体标签 | Myc |
| 报告基因 | Venus (1-154, I152L) |
| 抗性基因 | Ampicillin |
3. pBiFC-bFosVC155
pBiFC-bFosVC155 参数
| 骨架质粒 | pMyc-CMV |
| 质粒用途 | BiFC 实验 |
| 适用体系 | 哺乳动物细胞 |
| 质粒大小 | 4352 bp |
| 载体标签 | HA |
| 报告基因 | c-Fos(118-211)-Venus(155-238) |
| 抗性基因 | Ampicillin |
| 5' 端测序引物 | CMV-F |
| 3' 端测序引物 | EBV-Rev |
配套使用建议：pBiFC-VC155 与 pBiFC-VN173 是经典配套组合，骨架质粒分别为 pCMV-HA 和 pFlag-CMV，标签分别为 HA 和 FLAG，便于后续用标签抗体进行检测和验证。pBiFC-VN155(I152L) 可作为 pBiFC-VN173 的替代品，与 pBiFC-VC155 配套使用。
PART 03植物表达体系常用载体一览
植物体系的 BiFC 载体通常通过农杆菌介导的瞬时转化，在烟草等植物活体细胞中检测蛋白质互作。以下是常用的植物表达体系 BiFC 载体：
| 载体组合 | 骨架来源 | 特点与适用场景 |
|---|---|---|
| pCE-BiFC-VN173 / pCE-BiFC-VC155 | pCAMBIA 系列 | 适合烟草瞬时转化，带有 35S 启动子，表达效率高 |
| pSPYCE(M) / pSPYNE173 | pSPY 系列 | 经典的植物 BiFC 载体，在拟南芥和烟草中广泛应用 |
| pCCFP-X / pX-CCFP | — | 适用于特定蛋白互作体系，N/C 端连接方式灵活 |
| pX-NYFP / pNYFP-X | — | NYFP 系列载体，可满足不同实验需求 |
重要提示：植物体系 BiFC 载体的选择需要重点考虑：①启动子类型——35S 启动子适合组成型高表达，但某些情况下可能引起假阳性；②标签位置——目标蛋白连接在荧光片段的 N 端或 C 端可能影响互作，建议同时构建两种版本进行验证；③农杆菌菌株兼容性——不同载体对 GV3101、EHA105、LBA4404 等菌株的转化效率不同。
PART 04载体选择决策图：植物还是哺乳？
确定实验目标
→
目标宿主细胞？
→
🌱 植物细胞
→
pSPYCE/pSPYNE 系列
pCE-BiFC 系列
pCE-BiFC 系列
或
🐭 哺乳细胞
→
pBiFC-VC155
+ pBiFC-VN173
+ pBiFC-VN173
图4 BiFC 载体选择决策图
选择建议：研究植物细胞内蛋白互作 → 植物表达体系（pSPYCE/pSPYNE 或 pCE-BiFC 系列）；研究哺乳动物细胞内蛋白互作 → 哺乳表达体系（pBiFC-VC155 + pBiFC-VN173）。如果不确定，可先用酵母双杂交或 Co-IP 验证互作是否真实存在，再选择 BiFC 系统进行可视化验证。
PART 05载体构建实操要点
1确保正确阅读框
目标基因必须与荧光蛋白片段保持正确阅读框，避免移码突变。建议在构建前用软件模拟翻译，确认融合蛋白序列无误。
2选择合适的连接顺序
目标蛋白可连接在荧光蛋白片段的 N 端或 C 端，需根据蛋白结构和功能选择。对于某些蛋白，连接在 N 端可能影响其与搭档蛋白的结合，建议同时构建两种版本进行验证。
3注意酶切位点
选择载体上合适的酶切位点，注意不要破坏荧光蛋白片段序列。建议先查阅载体图谱，确认可用酶切位点。
4避免引入终止密码子
插入片段不能引入提前终止密码子，否则融合蛋白会被截短，无法形成完整的荧光蛋白。
5测序验证
构建完成后必须通过测序验证序列和阅读框的正确性，这是最容易被忽略但最关键的一步。
常见错误：①阅读框错误——目标基因与荧光片段不在同一阅读框，导致表达产物无法互补；②连接顺序不当——目标蛋白连接在不利的一端，导致空间位阻影响互作；③终止密码子未去除——插入片段携带终止密码子，融合蛋白被截短；④未测序验证——直接用于实验，浪费时间和试剂。
PART 06常见问题解答（FAQ）
BiFC载体的设计原理是什么？
构建于BiFC载体的荧光蛋白片段，是将荧光蛋白在某些特定的位点切开的，形成了不发光荧光的2个多肽，靠近N端的称为N片段（N-fragment），另一个是C片段（C-fragment）。N片段与C片段在细胞内共表达或体外混合时，不会自发靠近，相互结合成完整的荧光蛋白，需要借助与它们融合表达的蛋白间的相互作用，N片段和C片段才能在空间上相互靠近互补。因此融合了由荧光蛋白N片段和C片段的载体模板是BiFC实验的关键。
哺乳表达体系常用的BiFC载体有哪些？
哺乳表达体系常用载体包括：①pBiFC-VC155与pBiFC-VN173——常配套使用，骨架质粒分别为pCMV-HA和pFlag-CMV，载体标签为HA和FLAG，报告基因分别为VC155和Venus(1-172)，质粒大小分别为4088 bp和5216 bp；②pBiFC-VN155(I152L)——骨架质粒为pMyc-CMV，可替代pBiFC-VN173与pBiFC-VC155配套使用，报告基因为Venus(1-154, I152L)；③pBiFC-bFosVC155——骨架质粒为pMyc-CMV，报告基因为c-Fos(118-211)-Venus(155-238)。
植物表达体系常用的BiFC载体有哪些？
植物表达体系常用BiFC载体包括：①pCE-BiFC-VN173和pCE-BiFC-VC155；②pSPYCE(M)和pSPYNE173；③pCCFP-X和pX-CCFP；④pX-NYFP和pNYFP-X。这些载体通过农杆菌介导的瞬时转化，在烟草等植物活体细胞中检测蛋白质互作。
如何选择哺乳体系还是植物体系的BiFC载体？
选择依据是实验的目标宿主细胞。若研究哺乳动物细胞内蛋白互作，选择哺乳表达体系载体（如pBiFC-VC155/pBiFC-VN173）；若研究植物细胞内蛋白互作，选择植物表达体系载体（如pSPYCE/pSPYNE系列）。此外还需考虑目标蛋白的表达效率、标签兼容性和后续检测手段。
BiFC载体构建时需要注意什么？
BiFC载体构建需要注意：①阅读框——目标基因必须与荧光蛋白片段保持正确阅读框，避免移码突变；②连接顺序——目标蛋白可连接在N端或C端，需根据蛋白结构和功能选择；③酶切位点——选择载体上合适的酶切位点，注意不要破坏荧光蛋白片段序列；④避免终止密码子——插入片段不能引入提前终止密码子；⑤测序验证——构建完成后必须通过测序验证序列和阅读框的正确性。
BiFC载体的荧光蛋白片段会自发互补吗？
理论上BiFC载体的N片段和C片段在细胞内共表达时不会自发靠近并互补发光，需要借助与它们融合表达的目标蛋白之间的相互作用。但在实际实验中，过表达或荧光片段浓度过高时，可能会出现低水平的自发互补，导致假阳性信号。因此需要设置严格的阴性对照，并控制表达量。
猜您想看：
- 双分子荧光互补实验指南：双分子荧光互补的原理、优缺点、实验流程（烟草体系）以及一些实验的注意事项。
- 双分子荧光互补FAQ：什么是有效光？结果显示无信号？信号弱？
- 农杆菌侵染：农杆菌侵染的实验流程。
- 酵母双杂交：从文库中筛选未知互作蛋白。
- Co-IP服务：验证内源蛋白互作。
- GST pull-down：验证体外直接互作。
相关服务
联系我们
 |
南京栖霞区红枫科技园A6栋2层 |
 |
E-mail：order@zoonbio.com |
 |
技术热线电话: 400-066-8086 |
 |
025-85634800 025-85454800 025-85774800 025-84448440 |