一般大家会根据自己研究的物种来选择使用什么受体。

• 原生质体：没有细胞壁的不完整的植物细胞，对外界逆境反应很敏感。有些基因表达后蛋白对原生质体有一定的毒性作用，导致无法观察到荧光。因为细胞器分散，定位到具体细胞器的基因更适合在原生质体中表达，观察更明显。
• 烟草植株：通过注射法浸染烟草细胞，完整的植物细胞对逆境的抗性更强，所以表达后容易观察到荧光。如果有些基因表达时间较长，则更适合在烟草中操作。

不同的基因之间表达上存在很大的差异，且表达时间也各有不同。

• 针对无信号：建议至少重复两到三次实验，如果还是没有结果，建议改用烟草叶片侵染，因为有些基因对原生质体有一定毒性，且在原生质体中表达时间比烟草短，其次原生生物和真核生物对相同的基因的表达存在一定差异。
• 针对信号弱：建议在载体构建上增强启动子，并至少重复做两到三次转化。

首先确认载体是否有问题，甚至可以对调 N 端和 C 端的目的基因。有些基因表达时间长，在原生质体中表达不明显，可以尝试在烟草体系中表达，且适当调节观察时间，以便观察到更明显的结果。

此外，还可以考虑：①优化农杆菌浓度；②调整共培养温度；③更换荧光蛋白片段组合；④延长观察时间至 5-7 天。

各种基因预测定位都是基于现有的生物学数据和已有的生物学知识，在不同的模型或算法基础上建立的不同分析程序有一定的适用范围和相应的限制条件。生物信息学的预测结果只能作为参考，为后续试验提供研究思路，但具体的表达情况还是有所差异。

而且有些蛋白是会在多种细胞器中穿梭行使功能，所以定位于多种位置上也是正常现象。

在制片过程中时，尽可能清理干净叶片表面的杂质，排除气泡；看显微镜时，激发光电压不能打得太高，烟草细胞的轮廓清晰可见，且分布均匀。

由于在酵母双杂实验中 BD 融合诱饵蛋白有单独激活作用，且 AD 融合靶蛋白如果有 DNA 的特异性结合，也可以单独激活报告基因的表达，导致最后的实验结果出现假阳性。有些重组还可能会破坏蛋白之间的互作，且不同外源基因的瞬时表达效率大不相同。

建议在 BiFC 之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。

BiFC 假阳性主要来源于荧光蛋白片段的自发互补或非特异性聚集。避免策略包括：

• 设置严格的阴性对照——表达 N 端片段和 C 端片段但不融合目标蛋白、仅表达一个片段等；
• 控制表达量——过表达可能导致非特异性互补；
• 使用不同荧光蛋白对进行交叉验证；
• 结合其他互作验证方法（Co-IP、GST pull-down）进行正交验证。

需要分情况判断。如果目标蛋白本身在多种亚细胞结构中均有分布，那么多点信号是正常的；但如果目标是明确定位在细胞核或细胞膜的蛋白，而 BiFC 信号弥散分布，则需要考虑是否存在过表达导致的非特异性聚集。建议降低表达量、设置阴性对照、结合亚细胞定位标记物进行共定位分析。

BiFC 实验至少需要设置四组对照：

1. 阳性对照：已知互作的蛋白对（如 bFos/bJun），验证实验体系是否正常工作；
2. 阴性对照：已知不互作的蛋白对（如 bFos/ΔbJun），用于判断信号的背景水平；
3. N端片段空载体对照：N 端融合目标蛋白 A + 空 C 端片段；
4. C端片段空载体对照：空 N 端片段 + C 端融合目标蛋白 B。

只有实验组有明确荧光、所有对照组无信号或信号极弱，结果才可靠。

BiFC 的荧光信号本质上是半定量的，可通过共聚焦显微镜拍摄后统计荧光细胞比例、平均荧光强度等参数进行比较，但 BiFC 信号强度并不完全与互作强度成正比。

原因在于荧光蛋白片段的互补效率受融合蛋白构象、表达水平、温度等多种因素影响。如果需要定量互作强度，建议结合 MST、SPR 或 ITC 等方法。

在烟草瞬时转化体系中，通常注射后 24-48 小时开始出现荧光信号，2-3 天信号达到最强，之后随着叶片衰老荧光信号逐渐减弱。不同基因表达时间差异较大，有些基因可能需要 3-5 天甚至 7 天才出现明显信号，建议注射后 2 天、3 天、5 天分别观察一次，确定最佳观察时间点。

烟草叶片 BiFC 实验的起始材料需求较低，一般一片 3-4 周龄的烟草叶片即可完成 1-2 组注射实验（每组包含实验组和多个对照组）。菌液用量方面，每个注射点约需 50-200 μL 混合菌液。

如果是原生质体体系，一般需要 5-10 片叶片的原生质体，约 1×10⁵ 到 1×10⁶ 个原生质体用于一次转化实验。

农杆菌菌液浓度是 BiFC 实验中的关键参数，OD₆₀₀=1.0 并不一定适用于所有基因。

• 浓度过高：可能导致叶片坏死、程序性细胞死亡，也可能造成非特异性信号（假阳性）；
• 浓度过低：表达量不足，信号弱或无信号。

建议设置 OD₆₀₀=0.3、0.5、0.8、1.0 等浓度梯度进行比较，在可以获得明确荧光信号的前提下尽量采用低浓度菌液。

不同方法检测的是互作的不同层面，结果不一致是正常现象，不能简单地判断孰是孰非。

• 酵母双杂交：检测的是蛋白在酵母细胞核内的互作，可能存在假阳性；
• Co-IP：检测的是细胞内或裂解液中的复合物，反映的是内源互作状态；
• BiFC：反映的是活细胞中蛋白在特定亚细胞位置的互作；
• GST pull-down：检测的是体外直接互作。

建议以多种方法交叉验证的结果为准：如果 Co-IP 和 BiFC 均为阳性、GST pull-down 也为阳性，则互作关系较为可信；如果只有 Y2H 阳性而其他方法阴性，需要谨慎下结论。