ABPP（基于活性的蛋白质组分析）是新型小分子靶点鉴定技术，其核心在于利用“活性分子探针”（ABPs）精准识别并标记具有生物活性的蛋白质。探针的反应基团将化学小分子“挂”到靶酶上，标签基团则负责将其从复杂体系中“钓”出来——由于探针针对靶酶活性定向设计，ABPP检测的是蛋白质的真实功能状态，而非简单分析表达量。

下面我们以案例为基础，分细胞培养、紫外光交联、蛋白的提取、生物正交法偶联生物素、磁珠钓取探针和蛋白等具体步骤，阐述ABPP的实验流程。

一、试剂和耗材

样品：1个样品

主要试剂、实验仪器

试剂名称
Pierce™ IP 裂解缓冲液	BCA Protein Quantification Kit	Bioeast Mag-SA
TBTA	Biotin-azide	TCEP
CuSO₄	DEPC 处理水	180kDa PrestainedProtein Marker
过硫酸铵	TEMED	Tris
SDS	丙烯酰胺	N,N'-亚甲基双丙烯酰胺
快速银染试剂盒	其它试剂均为国产分析纯。
主要实验仪器
超净工作台	紫外交联仪	台式高速离心机
台式高速冷冻离心机	蛋白电泳仪	蛋白电泳槽
移液器

二、实验方法及结果

3.1 细胞培养

3.1.1细胞培养

客户提供的非冻存状态的细胞株可直接放置培养箱中进行培养。

3.1.2细胞传代

T25cm²培养瓶长至底部密度80-90%，弃上清，1×PBS清洗，加入胰酶进行消化，消化时间到，轻轻拍打培养瓶两侧数次，观察细胞是否脱落，按1传3的比例进行扩大培养。

3.1.3细胞铺板

待细胞密度达到90%，直接弃上清，用0.25%胰酶溶液消化细胞，根据细胞株状态确认消化时间，消化时间到弃掉0.25%胰酶溶液，轻轻拍打培养瓶两侧数次，收集细胞悬液，1000rpm，离心5 min，弃上清，用新鲜培养基重悬沉淀，记数备用。将细胞按照5000个/孔，100 μL/孔的细胞量铺于96孔细胞培养板中，放置于37℃，5%二氧化碳含量的培养箱中进行培养，待细胞贴壁后加入，添加受试物，对照品，每种做三个重复，培养24 h后弃去培养液，1×PBS洗涤一遍，加入含有CCK-8溶液的培养基，培养4 h，取90 μL培养上清测试450 nm吸光值结果。

3.1.4统计分析方法和结果

分析方法： 细胞存活率=[(As-Ab)(Ac-Ab)]*100% 细胞抑制率=1-细胞存活率

3.2 紫外光交联(根据偶联药物确定是否做光交联)

提前将紫外光交联仪器托盘底部铺上冰块，以便放置培养皿，孵育结束后将细胞培养皿置于冰上，移去皿盖，在紫外光交联仪下（365nm，10W，1J/cm2）进行照射，确保灯管距离细胞表面5-10cm，光照15min。

3.3 蛋白的提取

(1) 对于贴壁细胞，用胰蛋白酶EDTA收获，然后以500×g离心5分钟。对于悬浮细胞，通过500×g离心5分钟获得；
(2) 用PBS悬浮细胞颗粒，清洗细胞；
(3) 将1×107细胞转移至1.5 mL离心管中，以500×g离心2-3分钟；
(4) 使用移液枪小心吸取并丢弃上清液，使细胞沉淀尽可能干燥，液氮冻干后，研磨棒迅速研磨；
(5) 采用Pierce™ IP 裂解缓冲液提取蛋白，加入cOmplete ULTRA Tablets，Mini，蛋白酶抑制剂混合物，涡旋使细胞完全悬浮，将离心管在冰上裂解15分钟； 在离心机中4℃（16000×g）以最大速度离心20分钟，收取上清；采用BCA法检测蛋白浓度。
(6) 在使用前，储存在-80℃。

3.4 生物正交法偶联生物素

(1) 测定总蛋白质浓度，并将其稀释至终浓度为1 mg/mL。
(2) 取不同组别的等量裂解物蛋白（200 µg），加入新鲜预混合的点击化学反应混合物（20 µmol/L生物素-N3、50 µmol/L TBTA、0.5 mmol/L TCEP和0.5 mmol/L CuSO4）。
(3) 将反应物室温温和混合孵育2小时。
(4) 1：1体积比加入预冷丙酮（-20°C）进一步沉淀，在冰浴中温和搅拌10-15min，离心（12000×g，4°C下10分钟）去除残留丙酮。
(5) 将蛋白重悬于PBS中。

3.5 磁珠钓取探针和蛋白

实验具体分组如下：（组别根据客户要求设计）

编号	1	2	3
实验组蛋白	+	-	-
未标记药物对照组蛋白	-	+	-
炔烃对照组蛋白	-	-	+
Bioeast Mag-SA	+	+	+

(1) 取适量Bioeast Mag-SA，用冰冷PBS洗三次，置于磁力架上分离磁珠和液体，小心的移去上清；
(2) 分别混合实验组蛋白、未标记药物对照组、炔烃对照组蛋白各200ug和50 µl Bioeast Mag-SA，置于4℃孵育1小时；
(3) 置于磁力架上分离磁珠和液体，小心的去除上清，收集磁珠；
(4) 用冰冷PBS洗Bioeast Mag-SA三次，置于磁力架上分离磁珠和液体，尽可能去除上清，收集磁珠；
(5) 加入40µl蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮10分钟。

3.6 SDS-PAGE检测

(1) 样品制备：样品中加入Loading Buffer，100°C10 min。
(2) 电泳条件：5%浓缩胶：90V，30min；10%分离胶：120V，90 min。
(3) 电泳结束后进行银染，拍照记录跑胶图片用于分析。

3.7 实验结果

图1 SDS-PAGE检测分析图
Fig.1SDS-PAGE detection analysis
Lane M: Protein Marker
Lane 1:实验组蛋白+Bioeast Mag-SA
Lane 2: 未标记药物对照组蛋白+Bioeast Mag-SA
Lane 3: 炔烃对照组蛋白+Bioeast Mag-SA

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