酵母双杂交的建库工作就像搭积木——一步歪，步步歪！ RNA降解、载体选择、重组效率、转化不均 这些坑，分分钟让建出来的库变成“豆腐渣工程”，筛库时哭都来不及！

本文我们根据酵母双杂交建库（gateway法）的实验流程，结合钟鼎生物的实例，整理出（9+6+4）的建库质量标准，即九大步骤+六个结论+四次测序质控。

建库交付质量标准

九大步骤+六个结论+四次测序质控

第一步：Total RNA 提取及质控

①Total RNA 琼脂糖凝胶电泳成像：

琼脂糖凝胶电泳结果显示 RNA 主带清晰明亮，无拖尾，完整性良好。

②onedorp 紫外分光光度计测定 Total RNA 总量大于 300ug

结论 1：Total RNA 经检测符合 Gateway 建库要求，可以安排 mRNA 富集实验。

第二步：mRNA 富集及质控

①mRNA 富集琼脂糖凝胶电泳成像：

琼脂糖凝胶电泳结果显示 mRNA 呈弥撒状，主片段 750bp-2kb

②onedorp 紫外分光光度计测定 mRNA 总量大于 4ug

结论2：mRNA 经检测符合 Gateway 建库要求，可以安排反转合成 ds cDNA。

第三步：合成含有 attB2 位点的 ds cDNA 及质控

①ds cDNA 富集琼脂糖凝胶电泳成像：

琼脂糖凝胶电泳结果显示 ds cDNA 呈弥撒状，片段大小为 100bp-4kb

②onedorp 紫外分光光度计测定 ds cDNA 总量大于 4ug

结论 3：ds cDNA 经检测符合 Gateway 建库要求，可以安排 ds cDNA 与三框 attB1重组接头连接。

第四步、cDNA 与三框 attB1 重组接头连接

第五步、cDNA 分级分离及收集

结论 4：onedorp 紫外分光光度计测定回收产物浓度大于 300ng，符合 Gateway建库要求，可以安排初级重组。

第六步：初级重组及初级文库构建，电转，库容量鉴定、插入阳性率、插入片段大小，两次测序验证。

①库容量鉴定（标准：库容大于 1.0×10⁷）h

电转测序：随机挑取初级文库库容平板（电转复苏之后所涂）上面克隆进行测序验证（确定物种信息，排除污染）

②插入阳性率及插入片段大小鉴定（标准：插入阳性率大于 90%，平均插入片段大于 1kb）

第七步、初级文库质粒提取

①onedorp 紫外分光光度计测定初级文库质粒总量大于 200ug
②文库质粒测序：随机挑取初级文库质粒转化大肠杆菌之后生长平板上的克隆挑取测序验证。（确定物种信息，排除污染）

结论 5:经检测初级文库符合质量标准，安排次级文库构建。

第八步、次级重组及次级文库构建，电转，库容量鉴定、插入阳性率、插入片段大小，两次测序验证。

①库容量鉴定（标准：库容大于 1.0×10⁷）

电转测序：随机挑取次级文库库容平板（电转复苏之后所涂）上面克隆进行测序验证（确定物种信息，排除污染）

②插入阳性率及插入片段大小鉴定（标准：插入阳性率大 90%，平均插入片段大于 1kb）

第九步、次级文库质粒提取

①onedorp 紫外分光光度计测定次级文库质粒总量大于 200ug
②文库质粒测序：随机挑取次级文库质粒转化大肠杆菌之后生长平板上的克隆挑取测序验证。（确定物种信息，排除污染）

结论 6:经检测次级文库符合质量标准，文库构建结束。

实验报告案例展示

实验目的：构建 XXX 的酵母文库用于后续酵母单双杂实验。

实验原理：

该实验基于 Invitrogen 的 Gateway®克隆技术，与 SuperScript® III 逆转录酶的性能相结合，使得单链 mRNA 被反转成在两端包含 attB 位点的双链 cDNA；通过位点特异结合，有 attB 位点的 cDNA 直接克隆到有 attP 位点的初级载体pDONR222 上，获得含有 attL 位点的初级文库；随后将含有 attL 位点的初级文库和含有 attR 位点的次级载体 pGADT7-DEST 重组，即可整合成一个含有attB 位点的次级文库。

该文库构建方法不通过 PCR 的方式扩增 ds cDNA，能有效避免 PCR 的选择性抑制和竞争性扩增；同传统的限制性内切酶克隆方法相比，高效的 cDNA 与载体重组的方法能获得更多的初级克隆。此外，获得的初级文库还可以重组进多种不同次级目的载体上，来进行您所需的实验。

实验流程：
1.从 Total RNA 中分离 mRNA
2.合成含有 attB 位点的 ds cDNA
3.BP 重组构建初级文库
4.LR 重组构建次级文库

实验材料：
1.实验样本：XXXX
2.文库载体：pDONR222/pGADT7-DEST
3.主要试剂：

CloneMiner II cDNA Library Construction Kit	FastTrack MAG mRNA isolation Kit	SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR	1kb Plus DNA Ladder
UltraPure Agarose	Platinum Taq DNA Polymerase	100 mM dNTP Set	PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit
PureLink™ HQ Mini Plasmid DNA Purification Kit	UltraPure™ Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)	Ammonium acetate solution for molecular biology, 5 M	EZgene™ Plasmid Midiprep Kit II
Green Taq Mix

4.主要实验仪器

台式高速冷冻离心机	台式高速离心机	电转化仪	PCR 仪
超净工作台	电泳仪	凝胶成像仪	细菌摇床
生化培养箱	移液器	一次性培养皿	15 ml，50 ml 聚丙烯管
离心管

实验方法

1. mRNA 的分离纯化

1.1 Oligotex suspension 和 buffer OBB 37℃温浴充分后振荡混匀，室温放置；
1.2 Total RNA 用 RNase-free water 溶解至体积为 500 μl（可 65℃温浴 3 min，振荡混匀，至少重复两次）；
1.3 加入 500 μl buffer OBB 和 55 μl Oligotex suspension，充分混匀，70℃温浴 5 min；
1.4 室温放置 30 min，最大转速离心 2 min，吸上清；(上清保留至实验结束，如无问题，再弃上清)；
1.5 沉淀中加入 400 μl OW2，混匀后转到吸附柱中（吸附柱放入 1.5 ml 离心管中），最大转速离心 1 min；
1.6 将吸附柱放入新的 1.5 ml 离心管中，加入 400 μl OW2，最大转速离心 1 min；
1.7 将吸附柱放入新的 1.5 ml 离心管中，加入 70 μl buffer OEB (70℃)，充分悬浮，最大转速离心 1 min；
1.8 重复上一步，收集离心液体并质检；
1.9 加 0.5 倍体积 NH₄OAC，3 倍体积无水乙醇，2 μl 糖原，轻轻混匀，-80℃放置 15-30 min，4℃，13,000 rpm 离心 20 min；
1.10 加 1 ml 70%乙醇，洗涤 1 次，常温离心，去除上清；
1.11 空气中晾干，加 7 μl 水溶解，吹打 20 次。

图 1 mRNA 分离结果

mRNA 电泳结果为一片模糊的拖带，这是由于 mRNA 的长度不一所造成的； 一般情况下，判断 mRNA 质量是看拖带最亮部分的范围是否在较大的分子量范围内，如果该部分的范围小于 500bp，则可以认定 mRNA 已出现降解（特殊样本除外）。有时在拖带中会有一些模糊的 rRNA 条带残余，这可以在反转录的过程中进一步去除。

2. 合成含有 attB 位点的 ds cDNA

2.1 cDNA 第一链的合成

2.1.1 取上步骤中得到的 mRNA 按下表标示体积溶于 DEPC 水中

Reagent	µg of Starting mRNA
	≤1	2	3	4	5
Volume of DEPC water	11 μl	10 μl	9 μl	8 μl	7 μl

2.1.2 加入 biotin-attB2-Oligo(dT) Primer (30 pmol) 1 μl，dNTPs（10 mM each）1μl 混匀，70℃，5 min，降温到 45℃孵育 2 min。
2.1.3 加入 5×First Strand Buffer 4 μl，DTT（0.1 M）2 μl。
2.1.4 按下表加入 SuperScript III RT 酶，PCR 仪上反应 45℃，20 min；50℃，20 min；55℃，20 min。

Reagent	µg of Starting mRNA
	≤1	2	3	4	5
Volume of DEPC water	11 μl	10 μl	9 μl	8 μl	7 μl
Total Volume	20 μl

2.2 cDNA 第二链的合成

2.2.1 在上述反应液中按下表加入各成分：

DEPC-treated water	91 μl
5×Second Strand Buffer	30 μl
10 mM (each) dNTPs	3 μl
E.coli.DNA Ligase(10 U/μl)	1 μl
E.coli.DNA Polymerase I(10 U/μl)	4 μl
E.coli.RNaseH(2 U/μl)	1 μl
Total Volume	150 μl

2.2.2 16℃孵育 2 h。
2.2.3 加入 T4 DNA Polymerase 2 μl， 16℃，10 min。
2.2.4 加入 0.5 M EDTA（pH8.0）10 μl，补水至 300 μl。
2.2.5 加入酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 300 μl，充分混匀 30 sec，静置 1 min；14,000 rpm，室温离心 5 min，小心将上清取入新的离心管中。
2.2.6 按下表加入各成分：

Glycogen (20 µg/μl)	1 μl
5 M NH4OAc	150 μl
100% ethanol	900 μl

-80℃，静置 15 min；14,000 rpm，4℃，离心 25 min，去上清。
2.2.7 加入 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀；14,000 rpm，4℃，离心 3 min，去上清。
2.2.8 加入 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀；14,000 rpm，4℃，离心 3 min，去上清。
2.2.9 室温 5-10 min 晾干 cDNA。
2.2.10 用 104 µl 的 DEPC 水反复吹打 30-40 次，溶解 cDNA。

图 2 二链合成结果

一般地，双链 cDNA 电泳胶图为一片弥散条带，长度通常在 0.1-4kb 间。

2.3 cDNA 与三框 attB1 重组接头连接

2.3.1 取 3 个 PCR 管，加入如下试剂，三种接头分三管，各连接一份

attB1 Adapter (1 µg/µl) F	4.5 μl
attB1 Adapter (1 µg/µl) R	4.5 μl
10×NEB Buffer 2	1 μl

95℃，5 min，取出至室温（或 25℃），45 min-1 h 左右，不可急剧降温或放冰上。

2.3.2 反应结束后往每一管里分别加入以下试剂：

cDNA	34 μl
10×Ligase Buffer	5 μl
T4 DNA Ligase(1 U/µl) NEB	1 μl
Total Volume	50 μl

混匀后 16℃，孵育 16-24 h。

2.4 cDNA 分级分离及收集

2.4.1 固定分级柱，将上盖打开，再打开下面的塞子。
2.4.2 待柱子中储存液流尽，加 0.8 ml TEN Buffer 清洗柱子，确定柱子流速为每 30-40 秒一滴，每滴 25-35 µl，否则需要更换柱子。
2.4.3 重复 2.4.2 步骤 3 次。
2.4.4 准备好 2 个新的 1.5 ml 离心管，标记 1，2。
2.4.5 将三份各 50 µl 的 cDNA 产物混匀加入柱子中，收集滤过产物于 1 号管。
2.4.6 再向柱子中加入 100 µl 的 TEN Buffer，收集滤过产物与 1 号管。
2.3.4.7 重复步骤 2.4.6 两次。
2.4.8 向柱子中加入 100 µl 的 TEN Buffer，收集滤过产物与 2 号管。
2.4.9 将 2 号管补充 TEN Buffer 至 1 号管体积。
2.4.10 按下表加入各成分：

Glycogen (20 µg/µl)	1 μl
5 M NH4OAc	0.5 V
100% ethanol	3.0 V

-80℃，静置 15 min；14,000 rpm，4℃，离心 25 min，去上清。
2.4.11 加入 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀；14,000 rpm，4℃，离心 3min，去上清。
2.4.12 加入 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀；14,000 rpm，4℃，离心 3 min，去上清。
2.4.13 室温 5-10 min 晾干 cDNA。
2.4.14 用 13 µl 的 DEPC 水反复吹打 30-40 次，溶解 cDNA。

3. BP 重组构建初级文库

3.1 初级重组反应

按下表加入各成分：

cDNA	13 μl
pDONR222 (200 ng/µl)	2 µl
BP Clonase® II enzyme mix	5 µl
Total Volume	20 µl

混匀后置于 25℃, 16-20 h。

3.2 电转化大肠杆菌 DH10B

3.2.1 按下表加入各成分：

ddH2O	80 μl
Glycogen (20 µg/µl)	1 µl
5 M NH4OAc	50 µl
100% ethanol	300 µl

-80℃，静置 15 min；13,000 rpm，4℃，离心 25 min，去上清。
3.2.2 加入 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀；14,000 rpm，4℃，离心 3 min，去上清。
3.2.3 加入 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀；14, 000 rpm，4℃，离心 3 min，去上清。
3.2.4 室温 5-10 min 晾干 cDNA。
3.2.5 用 10 µl 的 TE Buffer 反复吹打 30-40 次，溶解 cDNA。
3.2.6 先将 1 mm 电转杯-80℃预冷，在冰上，将 10 µl 重组产物和 50 µl 电转感受态细胞混匀，冰上 10 min，加入电转杯，冰上置 5 min。
3.2.7 TX ECM 630 电转化仪上电击条件设置为：

Voltage	1500 V
Resistance	200 Ω
Capacity	25 µF

电击后迅速向电转杯中加入 SOC 培养基 4 ml。
3.2.8 将电转物取入到新的 15 ml 离心管，置于 37℃，225-250 rpm 摇床培养1 h。
3.2.9 培养结束后，取 10 µl 涂布平板用于库容量鉴定；剩余培养物加入 100 ml 肉汤培养基（含相应抗性 Kan）中，30℃，200 rpm，过夜培养。

3.3 cDNA 初级文库质量鉴定

3.3.1 库容量的鉴定

取转化后细菌原液 10 µl 稀释 100 倍后，从中取出 50 µl 涂布 LB 平板（含相 应抗性 Kan），第二天计数
CFU/ml=平板上的克隆数/50 µl×100 倍×1×10³µl
文库总 CFU=CFU/ml×文库菌液总体积（ml）

图 3 初级文库库容量鉴定

在平板上共长出 1300 个单克隆，经计算：
CFU/ml=1300/50 μl×l00×1000 μl=2.6×10⁶
总克隆数 CFU=2.6×10⁶×4=1.04×10⁷

3.3.2 重组率和插入片段长度鉴定
随机挑取 24 个克隆进行菌落 PCR 鉴定，配制如下反应液：

ddH2O	10.5 µl
pDONR222-F（10 µM）	1 µl
pDONR222-R（10 µM）	1 µl
Green Taq Mix	12.5 µl
Total	25 µl

在 Thermal Cycler PCR 仪上按以下条件进行 PCR 反应：

反应	temp	time	cycles
1	95℃	3 min	1
2	95℃	15 s	25
3	58℃	15 s
4	72℃	2 min
5	72℃	5 min	1

1% Agarose 胶电泳鉴定

图 4 初级文库重组率鉴定

重组率=重组成功数量/克隆总数*100%=23/24*100%=95.8%
平均长度：>1000bp

3.4 初级文库质粒抽提

取过夜培养的肉汤培养基，按照质粒中量提取试剂盒说明书，提取初级文库质粒。

4. LR 重组构建次级文库

4.1 次级重组反应

将中抽得到的初级文库质粒,稀释到 300 ng/µl,按照以下体系建立次级重组反应：

初级文库质粒(300 ng/µl)	1 µl
pGADT7-DEST (300 ng/µl)	1 µl
LR Clonase II Mix	4 µl
ddH2O	14 µl
Total Volume	20 µl

混匀后置于 25℃，16-20 h。

4.2 电转化大肠杆菌 DH10B

4.2.1 按下表加入各成分：

ddH2O	80 µl
Glycogen (20 µg/µl)	1 µl
5M NH4OAc	50 µl
100% ethanol	300 µl

-80℃，静置 15 min；14,000 rpm，4℃，离心 25 min，去上清；
4.2.2 加入 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀；14,000 rpm，4℃，离心 3 min，去上清。
4.2.3 加入 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀；14,000 rpm，4℃，离心 3 min，去上清。
4.2.4 室温 5-10 min 晾干 cDNA。
4.2.5 用 10 µl 的 TE Buffer 反复吹打 30-40 次，溶解 cDNA。
4.2.6 先将 1 mm 电转杯-80℃预冷，在冰上，将 10 µl 重组产物和 50 µl 电转感受态细胞混匀，冰上 10 min，加入电转杯，冰上置 5 min。
4.2.7 TX ECM 630 电转化仪上电击条件设置为：

Voltage	1500 V
Resistance	200 Ω
Capacity	25 µF

电击后迅速向电转杯中加入 SOC 培养基 4 ml。
4.2.8 将电转物取入到新的 15 ml 离心管，置于 37℃，225-250 rpm 摇床培养1 h。
4.2.9 培养结束后，涂布平板用于库容量鉴定；剩余培养物加入 100 ml 肉汤培养基（含相应抗性 Amp）中，30℃，200 rpm，过夜培养。

4.3 次级文库质量鉴定

4.3.1 库容量的鉴定

取转化后细菌原液 10 µl 稀释 100 倍后，从中取出 50 µl 涂布 LB 平板（含相 应抗性 Amp），第二天计数
CFU/ml=平板上的克隆数/50 µl×100 倍×1×10³ µl
文库总 CFU=CFU/ml×文库菌液总体积（ml）

图 5 次级文库库容量鉴定

在平板上共长出 1400 个单克隆，经计算：
CFU/ml=1400/50 μl×l00×1000 μl=2.8×10⁶
总克隆数 CFU=2.8×10⁶×4=1.12×10⁷

4.3.2 重组率和插入片段长度鉴定
随机挑取 24 个克隆进行菌落 PCR 鉴定，配制如下反应液：

ddH2O	10.5 µl
pGADT7-F（10 µM）	1 µl
pGADT7-R（10 µM）	1 µl
Green Taq Mix	12.5 µl
Total	25 µl

在 Thermal Cycler PCR 仪上按以下条件进行 PCR 反应：

反应	temp	time	cycles
1	95℃	3 min	1
2	95℃	15 s	25
3	58℃	15 s
4	72℃	2 min
5	72℃	5 min	1

1% Agarose 胶电泳鉴定

图 6 次级文库重组率鉴定

重组率=重组成功数量/克隆总*100%=24/24*100%=100%
平均长度：>1000bp

4.4 次级文库质粒抽提

取过夜培养的肉汤培养基，按照质粒中量提取试剂盒说明书，提取次级文库质粒。

实验结论：

本实验以 XXX 为起始材料构建了酵母单双杂文库，经计算，初级文库库容 1.04×10⁷，重组率 95.8%，平均插入片段长度>1000 bp；次级文库库容1.12×10⁷，重组率 100%，平均插入片段长度>1000 bp。各项指标质量均合格，可用于后续酵母单双杂实验。

相关服务