ChIP，是研究蛋白-DNA互作的金标准技术。染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种检测在体内自然染色质环境下蛋白和DNA相互作用的有效方法。这种技术广泛应用于检测特定基因调节蛋白结合在基因组中的具体位置或者基因调节区域和蛋白的修饰是否相关，日益成为研究真核细胞中转录调控情况的重要工具。本文系统介绍 ChIP 的原理、完整实验流程（8 个步骤）和实验成功的关键因素，附纯 CSS 配图和实验设计要点，供大家参考。
- ChIP 原理与技术概述
- ChIP 8 步工作流总览
- 实验流程详解：从甲醛交联到 DNA 纯化
- 下游分析：qPCR 还是 ChIP-Seq
- 实验成功三大关键因素
- 常见问题解答（FAQ）
染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种检测在体内自然染色质环境下蛋白和DNA相互作用的有效方法。这种技术广泛应用于检测特定基因调节蛋白结合在基因组中的具体位置或者基因调节区域和蛋白的修饰是否相关，日益成为研究真核细胞中转录调控情况的重要工具。
完整的 ChIP 实验包括交联、染色质断裂、免疫沉淀、洗涤、洗脱、逆转交联、DNA 纯化和下游分析 8 个核心步骤。每一个步骤都可能成为实验的成败关键。
10-20 min
SDS裂解
4℃过夜
琼脂糖珠
洗脱3次
过夜
或硅胶柱
ChIP-Seq
3.1 甲醛交联细胞
细胞在 100 mm 培养皿上生长到 80%~90%。当第一次使用细胞系做实验时，另外培养两个培养皿，一个用于预测细胞数量，另外一个用于优化超声条件。
去除上清培养液，加入 10 mL 1×PBS 含有终浓度为 1% 甲醛（加入 270 μL 37% 甲醛到 10 mL PBS）固定交联细胞，轻柔混合后置于室温 10~20 min。
加入 1 mL 1.25 mol/L 甘氨酸（终浓度为 0.125 mol/L）终止交联反应，甘氨酸终止甲醛的固定作用是通过提供过量的氨基团与甲醛结合。继续放在室温 5 min。
吸取走上清液后，用 10 mL 预冷 1×PBS 洗两遍后，以去除残留的甲醛。
加入 4~5 mL 预冷 1×PBS，能足够覆盖培养皿的表面，再用细胞刮棒刮落细胞，转移到 50 ml 锥形离心管，再用 4~5 mL 预冷 1×PBS 冲洗培养皿以收集残留的细胞。
4000 rpm 离心 5 min（4℃）。
去除上清，用 1 mL 预冷 1×PBS（新鲜加入 1×PIC 10 μL）悬浮细胞后，转移到 1.5 mL 离心管。
4000 rpm 离心 5 min（4℃）得到细胞沉淀，去除上清（细胞沉淀可放于 -80℃ 冰箱保存）。
3.2 染色质超声断裂
加入 1 mL SDS 裂解溶液重悬沉淀（新鲜加入 1×PIC 10 μl），在冰上放置 10 min，每隔 1 min 颠倒摇动离心管。SDS 能裂解细胞膜和核膜，使固定染色质释放出来，这样有利于超声。
用超声细胞粉碎机把 DNA 打碎为长度在 200~1000 bp，把样品放在冰上操作。不同细胞样本都得进行超声条件优化实验。
在超声后，14000 rpm 离心 10 min（4℃），转移超声染色质液体上清到 1.5 ml 离心管。上清液可放于 -80℃ 冰箱保存。
3.3 免疫沉淀蛋白和DNA复合物
使用 ChIP 稀释溶液把超声染色质液体稀释 10 倍，这样有利于免疫沉淀反应。例如 200 μL 超声染色质液体加入 1800 μL ChIP 稀释溶液（新鲜加入 1×PIC 20 μL）。
为了减少非特异性结合蛋白背景，往 2 mL 超声稀释液中加入 20 μL 蛋白 A/G 琼脂糖珠（Protein A/G Agarose Beads），在 4℃ 摇床轻柔摇动 1 h。
1000 rpm 离心 2 min（4℃），转移上清液到新的离心管，加入 1~4 μL 免疫沉淀抗体（每种抗体加入的量都不同）到上清液中，在 4℃ 摇床轻柔摇动过夜。另外取 50 μL 上清液，不加入抗体，作为阴性对照，以验证检测的特性。
3.4 收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA）
40 μL Protein A/G Agarose Beads 先用 1 mL 1×PBS 洗 3 遍，每次洗后 1000 rpm 离心 1 min，小心吸除上清，注意不要吸走 Beads。最后加 40 μL 1×PBS 悬浮 Beads。
打开样品的管盖，加入 40 μL Protein A/G Agarose Beads。在摇床上面摇动 1~2 h，4℃，以形成抗体-蛋白A免疫复合物。
1000 rpm 离心 5 min，4℃。去除上清，注意不要吸走 Beads。
清洗 Beads：免疫沉淀复合物依次用以下所列的缓冲液洗（每个 1 mL）。每次洗时，使样品在摇床上面 10 min，4℃，然后再 4000 rpm 离心 5 min。吸取上清时要注意不要吸走 beads。
- 低盐洗脱溶液 1 mL 洗一次；
- 高盐洗脱溶液 1 mL 洗一次；
- 氯化锂洗脱溶液 1 mL 洗一次；
- TE 溶液（pH 8.0）1 mL 洗两次。
3.5 洗脱免疫复合物
加入 200 μL ChIP 洗脱溶液洗脱 Beads，放在摇床上室温摇动 10 min。12000 rpm，离心 1 min，把上清转移到新的 1.5 mL 离心管。
再加入 200 μL ChIP 洗脱溶液洗脱 Beads，放在摇床上室温摇动 10 min，一共洗脱 3 次，得到 600 μL 洗脱液。洗脱液中含有目的蛋白以及其结合的相关 DNA。
3.6 去除甲醛交联
加入 24 μL 5 mol/L NaCl 到 600 μL 样品中（NaCl 终浓度为 0.2 mol/L），包括上述 1.3 中的 50 μL 阴性对照（加入 350 μL ChIP 洗脱溶液和 16 μL 5 mol/L NaCl）。
65℃，过夜去除甲醛交联。甲醛能够在有盐离子和去污剂的高温环境下解除交联反应，使得蛋白质和 DNA 分离。
3.7 DNA 纯化
DNA 纯化可以通过酚/氯仿抽提或者通过硅胶柱纯化。
对所有实验样本（600 μL）和 50 μL 阴性对照样本，分别加入 10 μg RNase A，在 37℃ 放置 30 min，以去除 RNA。然后加入 50 μg 蛋白酶 K，在 37℃ 放置 1 h。
加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀，12000 rpm 离心 5 min。
小心吸取上清液到新的 1.5 mL 离心管，加入 1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠和 2 倍体积冰冻无水乙醇，顺时针混匀后，放在 -80℃ 冰箱 1 h。
12000 rpm 离心 20 min，4℃。小心去除上清，注意不要吸走 DNA 沉淀，然后再加入 70% 乙醇，悬浮沉淀，12000 rpm 离心 10 min，去除上清，让 DNA 沉淀干燥。
用 40 μL TE 溶解 DNA 沉淀。
3.8 染色质免疫沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定
如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列是目的蛋白的靶序列，可以根据靶序列设计引物，用荧光定量PCR的方法，比较特异性和非特异性免疫抗体所沉淀的 DNA 的 PCR 产物的量，或者比较根据靶序列设计的引物和远离靶序列设计的引物的 PCR 产物的量。比值越大，则说明靶序列 DNA 与目的蛋白相结合的可能性越大。
如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量研究目的蛋白在基因组的分布情况，找出转录因子的结合位点，可以采用 ChIP 克隆测序、DNA 芯片（ChIP-chip）和 ChIP-seq 方法。
ChIP克隆测序实验过程：
- 用 T4 DNA 聚合酶使目的 DNA 的 3' 突出末端平滑化，5' 突出末端补平，从而形成平滑末端。10 μL 反应体系（1 μL 10×T4 DNA 聚合酶缓冲液，1 μL 1 mmol/L 的 dNTP，1 μL T4 DNA 聚合酶，7 μL DNA 溶液），37℃ 1h。
- 往体系中加入 1 μL 10 mmol/L 的 dATP，1 U 的 Taq 聚合酶，72℃ 一个小时，使 DNA 的 3' 添加上 A 碱基。
- 建立连接反应：10 μL 反应体系（1 μL 10×T4 DNA 连接缓冲液，1 μL T4 DNA 连接酶，7.5 μL 步骤 2 的反应产物，0.5 μL T 载体），室温 1h。
- 把连接产物加入到 100 μL 感受态细胞中，冰上 30 min，42℃ 热激活 90s，再放冰上 2 min 后，加入 900 μL LB 培养液 37℃ 培养 45 min，最后涂板到含有 Amp 的 LB 平板培养皿。
- 第二天从平板上随机挑取克隆单菌落，摇菌 6h 后，抽提质粒。
- 用限制性内切酶酶切质粒后，在 1% 琼脂糖胶电泳，而用空载体进行比较，从中选取插入片段大于 500 bp 的重组载体进行测序（小于 500 bp 的插入片段大多是非特异免疫沉淀的 DNA）。
- 对插入片段测序后，与 GenBank 中的数据进行比较（BLAST），寻找所测序列附近含有开放阅读框（ORF），该序列是转录因子结合的位置，对感兴趣的序列可做进一步的分析。
| 方法 | 适用场景 | 核心优势 | 主要局限 |
|---|---|---|---|
| ChIP-qPCR | 已知结合位点，验证性研究 | 成本低、周期短、操作简单 | 通量低，只能检测有限位点 |
| ChIP-Seq | 未知结合位点，探索性研究 | 全基因组范围，通量高 | 成本高、需生信分析 |
| ChIP-chip | 特定区域或启动子芯片 | 聚焦感兴趣区域 | 芯片覆盖范围有限 |
| ChIP克隆测序 | 初步筛选未知位点 | 成本低、可筛选大片段 | 通量低、假阳性较高 |
时间太长——抗原表位被屏蔽，超声困难
太长——分辨率低，背景高
先做 WB 验证抗体能否识别交联后表位
5.1 甲醛的固定交联程度
甲醛能使蛋白质和 DNA 固定交联形成复合物，能够真实反映细胞内蛋白质和 DNA 相互作用情况。最好使用新鲜的甲醛，注意甲醛是否已经过了有效期。刚开始进行染色质免疫沉淀实验时，甲醛固定的时间要进行优化。
- 固定时间太长：虽然会得到更多的蛋白质和 DNA 交联复合物，但是需要更多时间进行超声打碎，使得样品溶液过热导致蛋白质和 DNA 变性。另外，过度固定交联，会使目的蛋白内的抗原决定簇被屏蔽，不能和抗体有效结合，而引起免疫沉淀下降。
- 固定时间太短：蛋白质和 DNA 形成的复合物交联不牢固，很容易在超声时分离，可能在离心步骤时引起丢失。
5.2 超声打碎染色质样本所获得的DNA片段大小
用于染色质免疫沉淀实验的最佳 DNA 片段要求在超声后为 200~1000 bp。获得恰当大小的 DNA 片段关系到实验的成败以及对实验结果的解释。因此要重视超声条件的优化实验。
5.3 抗体能否识别和免疫沉淀目的蛋白的有效性
目的蛋白抗体有效性也是染色质免疫沉淀实验的关键因素。要选择高质量、高亲和力和高效价的抗体来进行实验。先做 Western Blot 来检验在染色质免疫沉淀实验条件下抗体是否能够和目的蛋白的抗原决定簇结合而免疫沉淀。
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