本项目利用全长抗体药物A抗原免疫40只新西兰兔，获得针对全长抗体药物A抗原高效价兔抗血清，制备全长抗体药物A亲和纯化柱，进行抗原亲和纯化，随后将纯化抗体用Normal human IgG进行吸附反筛，最终获得ADA特异性抗体，并对抗体进行ELISA效价、纯度、浓度检测。

核心需求与研发目标

客户提供全长抗体药物A作为免疫原，委托开发针对该抗体的抗药物抗体(ADA)检测用兔多克隆抗体。旨在建立高特异性、高灵敏度的免疫分析体系，满足药物免疫原性评价的严苛标准。

应用价值：为生物药的安全性评价、临床药代动力学监测及免疫原性分析提供关键的试剂基础，是药物研发与上市监测的重要环节。

项目概览与核心目标

核心实验流程闭环

实验流程

阶段一（M1）：动物免疫及抗血清效价评估

1.1项目目标
将全长抗体药物A抗原免疫动物制备抗血清，完成抗血清效价评估，做出GO/NO-go决定。

1.2实验材料与主要仪器

试剂名称
全长抗体药物A	Normal human IgG	弗式完全佐剂	弗式不完全佐剂	山羊抗兔-HRP	TMB
主要仪器
台式高速冷冻离心机	pH计	分析电子天平	电热恒温培养箱	酶标仪	洗板机

1.3实验方法和操作

1.3.1动物免疫

免疫计划：全长抗体药物A作为抗原，免疫40只新西兰兔，每只皮下免疫200μg/次，2周免疫1次，免疫4次。具体免疫流程如下：

标准化免疫流程关键节点 (总周期52天)

Day 0	Day 0	Day 14	Day 28
基线采集 空白血清 阴性对照	初次免疫 CFA佐剂 启动应答	二次免疫 IFA佐剂 加强反应	三次免疫 IFA佐剂 维持水平
Day 35	Day 42	Day 49	Day 52
效价初筛 微量采血 ELISA检测	四次免疫 最后加强 提升滴度	终效确认 评估效价 确定时机	终末采血 颈动脉采血 收集抗血清

1.3.2抗血清效价检测

通过间接ELISA检测抗血清效价，间接ELISA操作步骤如下：

1.3.2.1用包被缓冲液将全长抗体药物A稀释成需要的浓度，混匀后加入96孔板中，每孔100 μL，4℃冰箱过夜。
包被抗原：全长抗体药物A，Normal human IgG
包被浓度：0.1 μg/mL，100 μL/孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS，pH7.4)
1.3.2.2取出96孔板，弃去包被液，用PBST洗板3次，每孔加入200 μL封闭液，37℃孵育1 h。取出96孔板，弃去封闭液，洗板1次。
1.3.2.3抗血清按1:1000，2倍稀释，每孔100 μL，37℃孵育1 h。
1.3.2.4取出96孔板，弃去孔内溶液，洗板3次，向每孔中加入100 μL稀释好的酶标二抗（酶标二抗配制：山羊抗兔-HRP，1:50000）。37℃孵育1 h。
1.3.2.5取出96孔板，弃去孔内溶液，洗板4次，每孔加入100 μL TMB显色液， 37 ℃，15 min。
1.3.2.6每孔加入100 μL 1 M HCL溶液，终止反应。立即在酶标仪上用450 nm波长读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值2.1倍的孔对应的抗血清最大稀释倍数，定为该样品的效价。

1.4实验结果

1.4.1四免后抗血清效价检测结果

间接ELISA法检测血清中抗体与全长抗体药物A结合的能力。具体结果如下：

（仅展示部分数据）

间接ELISA法检测血清中抗体与Normal human IgG结合的能力。具体结果如下：

（仅展示部分数据）

1.4.2结果分析
本项目共免疫40只新西兰兔，经过四次免疫后产生良好免疫反应。抗血清间接ELISA效价针对全长抗体药物A四免后达到512 K倍稀释。根据结果分析，兔血清效价已达到下游纯化要求。

1.5结论

通过对40只新西兰兔颈动脉取血，离心制备，最终获得针对全长抗体药物A的效价大于512 K的抗血清1600 mL。

阶段二（M2）：ADA多克隆抗体的亲和纯化

2.1项目目标

抗原亲和纯化获得大于20 mg的ADA特异性抗体。

2.2实验材料与主要仪器

试剂名称
全长抗体药物A	氨基胶	甘氨酸	Tris	山羊抗兔-HRP	TMB
主要仪器
HD-2 核酸蛋白检测仪	分析电子天平	电热恒温培养箱	酶标仪	洗板机

2.3实验方法和操作步骤

2.3.1抗血清纯化及鉴定

2.3.1.1抗血清纯化
将全长抗体药物A与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，取1600 mL抗血清与PBS等量混合后，与偶联全长抗体药物A后的琼脂糖凝胶混匀， 4℃旋转孵育3h，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4 ℃透析过夜。

2.3.1.2纯化抗体反筛
将Normal human IgG与琼脂糖介质偶联制备成亲和纯化层析柱，随后将2.3.1.1所得纯化抗体与Normal human IgG亲和纯化层析柱混合后，室温孵育5min，收集流穿液，重复以上步骤，用ELISA检测反筛后抗体与Normal human IgG交叉反应率，直到满足与Normal human IgG交叉反应率＜5% 则停止反筛，最终获得ADA特异性抗体。

2.3.1.3纯化鉴定
通过间接ELISA检测抗体的效价，此抗体按1:8000起始，2倍稀释，其余方法同1.3.2，用A280（消光系数1.37 mg⁻¹·mL·cm⁻¹）对抗体进行浓度测定、用SDS-PAGE电泳方法对抗体纯度进行鉴定。

2.4实验结果

2.4.1纯化结果

2.4.1.1纯化抗体得率数据分析表

抗体名称	抗体浓度（mg/mL）	抗体体积(mL)	抗体量（mg）
ADA特异性抗体	1.3	38.5	50

2.4.1.2纯化结果分析
亲和纯化1600 mL抗血清，获得50 mg ADA特异性抗体，间接ELISA测定ADA特异性抗体效价为4096 K，交叉反应率约为1.04%，小于5%，符合抗体纯化及反筛的预期。

2.4.1.3纯化ADA特异性抗体间接ELISA效价检测结果

2.4.1.4纯化ADA特异性抗体纯度鉴定
ADA特异性抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色鉴定，抗体纯度在90%以上。

图1纯化ADA抗体SDS-PAGE分析结果
M: 蛋白质分子量标准
1: ADA特异性抗体分析结果

2.4.1.5ADA特异性抗体应用检测
（1）Bridging ELISA效价检测
Bridging ELISA通过双抗体夹心法进行检测，操作步骤如下：
①　根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。
②　用PBS包被液将药物A稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100 μL，4℃冰箱过夜。
包被抗体： 药物A
包被浓度：0.1 μg/mL，100 μL/孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS，pH7.4)
③　包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200 μL封闭液，37℃恒温箱1 h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。
④　加样：分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，标准品孔加入ADA特异性抗体，余孔分别加待测样品100 μL，加上覆膜。37 ℃孵育60 min。
⑤　弃去孔内液体，甩干，洗板3次，大约350 μL/孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
⑥　每孔加稀释好的药物A-HRP 100 μL，加上覆膜，37 ℃孵育60 min。
⑦　弃去孔内液体，甩干，洗板8次，大约350 μL/孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
⑧　每孔加底物溶液(TMB)100 μL，酶标板加上覆膜室温避光孵育15 min左右（根据实际显色情况酌情缩短，当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。每孔加终止液100 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
⑨　立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。
由结果可知，Bridging ELISA检测灵敏度达7.81 ng/mL，具体检测结果如下：

（2）PK-Sandwich ELISA效价检测
PK-Sandwich ELISA通过双抗体夹心法进行检测，操作步骤如下：
①　根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。
②　用PBS包被液将ADA特异性抗体稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100 μL，4℃冰箱过夜。
包被抗体： ADA特异性抗体
包被浓度：0.1 μg/mL，100 μL/孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS，pH7.4)
③　包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200 μL封闭液，37℃恒温箱1 h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。
④　加样：分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，标准品孔加入药物A，余孔分别加待测样品100 μL，加上覆膜。37 ℃孵育60 min。
⑤　弃去孔内液体，甩干，洗板3次，大约350 μL/孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
⑥　每孔加稀释好的ADA特异性抗体-Biotin 100 μL，加上覆膜，37 ℃孵育60 min。
⑦　弃去孔内液体，甩干，洗板3次，大约350 μL/孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
⑧　每孔加稀释好的Streptavidin-HRP 100 μL，加上覆膜，37 ℃孵育60 min。
⑨　弃去孔内液体，甩干，洗板8次，大约350 μL/孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
⑩　每孔加底物溶液(TMB)100 μL，酶标板加上覆膜室温避光孵育15 min左右（根据实际显色情况酌情缩短，当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。每孔加终止液100 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
⑪　立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。
由结果可知，PK-Sandwich ELISA检测灵敏度达1.95 ng/mL，具体检测结果如下：

2.5 结论
亲和纯化1600 mL抗血清，经过Normal human IgG反筛，最终获得50 mg ，纯度＞90%的ADA特异性抗体，间接ELISA测定ADA特异性抗体效价为4096 K，交叉反应率为1.04%，符合实验预期。
Bridging ELISA检测结果显示ADA特异性抗体作为阳性对照，方法灵敏度在7.81 ng/mL左右；利用ADA特异性抗体建立的PK-Sandwich ELISA灵敏度在1.95 ng/mL左右。

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