酵母三杂交验证pBridge- MdPP2AC-MdPTPA与pGADT7- MdSnRK2.6的相互作用实验案例

一、目的

已知 MdPP2AC已被证明分别与MdPTPA和MdSnRK2.6相互作用。然而，在MdPTPA和MdSnRK2.6之间没有发现相互作用。为探究MdPTPA在MdPP2AC与MdSnRK2.6的相互作用中的角色，进行以下实验。

二、方法

以构建到pBridge载体上的MdPTPA（MCSII位点）、MdPP2AC（MCSI位点）基因为诱饵，以构建到pGADT7载体上的MdSnRK2.6基因为猎物，进行酵母三杂交，验证三者互作关系，进而推定MdPTPA在MdPP2AC与MdSnRK2.6的相互作用中的角色。

三、材料

1.诱饵质粒：pBridge- MdPP2AC-MdPTPA

2.猎物质粒：pGADT7- MdSnRK2.6

3.Clontech酵母三杂交系统

4.培养基

5.其他贮备液： 10 × TE：0.1 M Tris-HCl（pH7.5），10 mM EDTA，高压灭菌； 10 × LiAc：1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌。

四、实验方法及结果

（一）诱饵基因自激活检测

1. 酵母转化方法

（1）将 AH109 酵母菌种在SD-M平板上划线，30°C 培养箱倒置培养3天左右，直到克隆大小为2 - 3 mm；
（2）重复（1）3次，使AH109能够稳定合成甲硫氨酸。
（3）挑取一个酵母克隆于3 mL 的 YPDA 培养基中（15 mL 灭菌的离心管）；在30°C 摇床振荡培养约16 h（过夜），至 OD600 ＞1.5 ；
（4）吸取5 mL至50 mL YPDA 中（250 mL三角瓶），使OD600 = 0.3 ，在30°C 摇床 230 - 250 rpm振荡培养4-5 h，直至OD600 = 0.6~0.8；
（5）室温4000 rpm离心4 min以收集菌体；
（6）倒去上清并用20 mL无菌去离子水重悬酵母；
（7）室温4000 rpm离心4 min以收集菌体，倒去上清并用1.5 mL 1.1 x TE/LiOAc溶液重悬酵母；
（8）将重悬液吸至2 mL 离心管，高速离心15 s；
（9）倒去上清并将酵母重悬于600 μL 1.1 x TE/LiOAc 溶液；
（10）按照下表构建反应：

Bait plasmid	Prey plasmid	备注
pBridge-MdPP2AC-MdPTPA	pGADT7	自激活验证

（11）每管反应中加入10 μL预变性的Carrier DNA、300 μL 1 x PEG/LiOAc溶液，混匀；
（12）每管反应中加入50 μL重悬酵母感受态细胞，缓慢混匀；
（13）30°C水浴30 min，每10 min混匀一次；
（14）每管加入20 μL DMSO，混匀；
（15）42°C 水浴热激15 min，每5 min上下颠倒混匀一次；
（16）700 g离心5 min；
（17）弃掉上清，用1 mL YPDA液体培养基重新悬浮；
（18）30°C 摇床振荡复苏培养1 h；
（19）高速离心15 s；
（20）弃掉上清，用200 μL 0.9% NaCl溶液重新悬浮细胞。涂布相应的缺陷型平板。30℃ 恒温培养4d。

2. 诱饵自激活检测结果

DDO	TDO	QDO

在DDO/TDO/QDO上，pBridge-MdPP2AC-MdPTPA+pGADT7均能生长，证明诱饵存在自激活。需要通过在培养基中添加3-AT对诱饵的自激活进行抑制。

QDO	QDO+5mM 3-AT	QDO+10mM 3-AT	QDO+20mM 3-AT

由于Q+5 mM 3-AT可以抑制 Bridge-MdPP2AC-MdPTPA+pGADT7的活性，故选择此梯度作为筛选条件，继续实验。

（二）诱饵与猎物互作检测

猎物及诱饵共转AH109。方法同上，具体互作体系见下表。

Bait plasmid	Prey plasmid	备注
pBridge-MdPP2AC-MdPTPA	pGADT7- MdSnRK2.6	实验组
pBridge-MdPP2AC-MdPTPA	pGADT7	阴性对照

互作结果：

由上图可看出，对照菌液点至Q+5 mM 3-AT/Q-Met+5 mM 3-AT平板后，+X-α-GAL不变蓝，测试组+X-α-GAL说明转化实验结果成功。同时，测试组菌液点至Q+5 mM 3-AT/Q-Met+5 mM 3-AT平板后，前者长势与后者相似甚至略强于后者，说明激活MdPTPA（MCSII位点）后，MdPP2AC与MdSnRK2.6的互作效果变弱。

五、结论

MdPTPA在MdPP2AC与MdSnRK2.6的互作过程中起抑制作用。

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