多克隆抗体制备常见问题解析

1、免疫宿主该如何选择?

选择宿主时,一般要考虑两个问题:

(1)免疫效果能否保证。特别是对于蛋白抗原的情况,为了保证免疫成功,就要求宿主与抗原来源物种之间有较远的亲缘关系,如果不太能确定亲缘关系的远近,建议把抗原的序列与被免疫的宿主相应的蛋白的序列进行一个对比,优先选择同源性较低的物种进行免疫。

(2)抗血清产量的问题。根据实验目的不同,抗血清的用量也有所不同。如果后续是做Western Blot,那么只需要一点点血清就够了,这个时候就可以选用小Mouse这样的小宿主作为免疫宿主,而如果想生产二抗作为商业使用,则可选用羊、驴、马这样的大型宿主,大型宿主还可以进行多次放血,以提高宿主的利用率

钟鼎生物目前能够提供的多物种多克隆抗体制备包括:

monkey Alpaca goat rabbite Mouse Chicken
monkey Alpaca goat rabbite Mouse Chicken
抗体制备
用于抗体药及生物大分子药的免疫原性测定,产生药代动力学分析方法建立过程中的阳性抗体。 基于Alpaca重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构,逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。 体型较大,产生lgG,主要用于大规模抗体的制备,特别是商品化和工业级别应用。 最常用的免疫宿主,产生lgG,饲养成本适中,最适合科研级别应用。 产生lgG,饲养成本低,适用于少量抗体制备,更多应用于单克隆抗体制备。 制备特异性卵黄抗体lgY,产量大、特异性强、性质稳定,成本是其一大优势。

 

2、如何选择抗原?

(1)降解的蛋白抗原利于制备用于筛选细菌表达cDNA文库或免疫沉淀

(2)用于筛选真核细胞转染系统表达的cDNA文库或免疫沉淀,最好选用自然的蛋白抗原。

(3)如果制备抗独特型抗体,所用抗原可以是可溶性Ig分子,或者是完整的细胞,也可以是基因工程表达产品独特型决定簇、人工合成多肽及抗原化抗体等。

目前,以各类病原生物活体感染宿主而获得多克隆抗体(抗血清)作为检测抗体,仍是常用方法。

3、多克隆抗体有哪些优势?

(1)成本低廉,技术门槛低,制备周期短。

(2) 能识别一个抗原上的多个表位,可在IP等实验中获得更加理想的结果。

(3)多抗因为靶蛋白可在多个表位上结合不止一个抗体分子,有助于放大低表达水平的靶蛋白信号。

(4) 能识别出与免疫原蛋白具有高同源性的蛋白,或者从非免疫原物种的组织样品中筛选靶蛋白,例如当未测试物种中的抗原性质未知时,有时会使用多克隆抗体。

(5)可识别多个结构域,即使原始抗原的一些空间结构或者序列发生小变化或者部分抗原决定簇变化,仍可以识别抗原,因此有更大的适应性

4、多抗用来做Western Blot检测为何有杂带出现?

(1)你可能是用ProteinA/G来进行抗体纯化,这种纯化方式得到的多抗掺杂有宿主本身对其自身抗原产生的抗体,这些抗体在检测中会识别样本中的蛋白而出现杂带,建议采用抗原亲和纯化来避免杂带的产生。

(2)天然蛋白存在复杂的翻译后修饰。可以通过信息学分析来解释。

(3)翻译后蛋白前体经切割可能会使部分蛋白分子量偏小,而天然组织中同时存在蛋白前体和切割加工后的蛋白,二者序列有相同部分,可能会产生杂带。最好是通过查阅与目的蛋白相关文献进行了解。

(4)当目的蛋白有同源家族蛋白时,蛋白异构体的存在可能会使分子量偏离预测分子量,因为天然样本中由同一个mRNA不同的剪接方式进行翻译形成的蛋白产物也会有相同的抗原表位,同时被抗体识别时会产生杂带。

(5)强烈的蛋白间相互作用在还原条件下也有可能不解聚导致条带偏大。如二聚体或三聚体,这些多聚体的形式通常会抵制WB时所做的还原条件,因此造成检测的条带偏大。

5、多克隆抗体如何保存及运输?

我们的抗体是添加5%甘油,免疫前血清和抗血清已添加0.02%防腐剂,若客户有其他要求,会提前告知生产;抗体会超低温包装运输寄送, 收到抗体请尽快检测,建议分装成小包装(分装为每次使用量)后保存于-80摄氏度冰箱,并避免反复冻融, 保存时间若超过1年,使用前请先电泳检测蛋白是否降解。

6、制备的多克隆抗体是否可以保证后续WB实验?

制备抗体的抗原是原核重组表达的蛋白,与后续用于WB的天然蛋白样品是有差异的,无法保证构象及活性与天然蛋白一致,所以不能保证后续应用于天然蛋白的WB,但可以保证制备出的抗体与抗原蛋白是WB呈阳性的。


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