小分子抗原制备及偶联服务案例

一、摘要

　利用偶联的莫西沙星-BSA小分子抗原免疫Balb/c小鼠，用偶联莫西沙星 -OVA小分子抗原筛选检测鼠血清效价，待鼠血清与莫西沙星-OVA小分子抗原有反应同时与莫西沙星小分子有竞争反应的小鼠，可以用于细胞融合，最终获得与莫西沙星-OVA小分子抗原有反应、与莫西沙星小分子有竞争反应的单克隆阳性细胞株及抗体。

二、试剂和耗材

名称	公司	名称	公司
Balb/c小鼠18±2g	南京钟鼎生物	抗原	钟鼎订购莫西沙星小分子
弗氏佐剂	Sigma	二抗：羊抗鼠-HRP	南京钟鼎生物
0.22 μm无菌滤器和透析袋	Millipore	高糖DMEM培养基	购自Gibco公司
细胞计数板	购自Improved Neubauer	液体石蜡	南京钟鼎生物
PEG	购自sigama	96细胞培养板	购自Costar，批号3599
其它试剂均为国产分析纯。

三、主要实验仪器

仪器名称	公司	仪器名称	公司	仪器名称	公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机	美国BECKMAN公司	台式高速离心机	德国SORVAL公司	酶标仪、洗板仪	Thermo
320-S pH计	美国Mettler Toledo公司	AR5120电子天平	美国AHOM S公司	NANODROP2000	美国Thermo公司
MultiTemp III 恒温水浴锅	美国Amersham Pharmacia公司	雪花状制冰机	日本SANYO公司	超净工作台	中国苏净集团

四、实验方法及结果

1. 动物免疫

选取6只6-8周龄雌性BALB/c小鼠，将偶联莫西沙星-BSA小分子抗原与弗氏佐剂混合免疫，皮下注射100 ug，2-3周加强免疫一次。四免后采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对莫西沙星-OVA小分子抗原的效价，待效价大于1:10,000，同时与莫西沙星小分子有竞争效果的小鼠，选择1-2只小鼠进行细胞融合安排。

2.抗血清效价检测及筛选

2.1 抗血清间接ELISA效价检测

具体操作如下：

（1）根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。

（2）用PBS包被液将莫西沙星-OVA稀释成需要的5 ug/ml浓度，混匀后加入板条中，每孔100 ul，4℃冰箱过夜。
包被抗原：莫西沙星-OVA
包被浓度： 5 ug/ml, 100 ul/孔
包被缓冲液： 磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)

（3）包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200 ul封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

（4）纯化抗体按1/500，2倍稀释，每孔100 ul，37℃恒温箱1 h。

（5）取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100 ul稀释好的酶标二抗，酶标二抗： 山羊抗鼠-HRP，1/5000。37℃恒温箱1 h。

（6）取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100 ul TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37 ℃，15 min。

（7）每孔加入100 ul 1 M HCL溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450 nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。
具体结果如下：
包被抗原：莫西沙星-OVA
包被浓度：5 ug/ml, 100 ul / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
二抗：山羊抗鼠-HRP，1/5000

起始稀释度: 1:500
效价即样品OD/空白OD＞=2.1的最高稀释度

2.2 免疫后小鼠血清竞争ELISA 结果

包被抗原： 莫西沙星-OVA小分子抗原
包被浓度： 5 ug/ml, 100 ul / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
竞争小分子：莫西沙星游离小分子，1 ug/ml起始，3倍稀释；
二抗： 山羊抗鼠-HRP，1/5000

3. 结果讨论分析

通过免疫后鼠抗血清与莫西沙星-OVA及莫西沙星小分子竞争检测的ELISA结果，可以得出，抗血清与莫西沙星-OVA小分子有反应，效价均达到要求，与莫西沙星小分子的竞争效果明显，可以进行下一阶段的细胞融合实验。

五、第二阶段实验

1.细胞融合

1.1 骨髓瘤细胞制备

融合前一周，用含10%FBS DMEM培养基扩大培养SP2/0细胞。到融合时，细胞长满大约6瓶T25细胞培养瓶，在融合当天收集SP2/0细胞到50 ml离心管中，1000 rpm,5 min离心。弃上清，然后再加入20 ml DMEM基础培养基，吹散细胞然后计数。

1.2 脾细胞制备

四次免疫后血清ELISA效价在1：10000以上的小鼠，在融合前3天终免，腹腔注射抗原100 ug。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。用75%酒精浸泡5 min。无菌取脾脏，把脾脏放入内有10 ml DMEM基础培养的培养皿中。取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏。加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至10 ml离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞两次，1000 rpm离心5 min，收集脾细胞计数。

1.3 细胞融合

混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1：20为宜。把细胞放到50 ml离心管中，用DMEM基础培养基稀释，然后离心1000 rpm 5 min。弃上清。摇动离心管使细胞均匀。缓慢加入0.8 ml 50%PEG，反应90秒，然后加入20-30 ml DMEM培养基终止PEG，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10分钟。1000 rpm, 5 min，弃上清然后加入HAT DMEM培养基。把融合的细胞铺到96孔板中，每孔100 μl。然后将细胞培养板放到CO2培养箱中培养。融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率在50%以上，有少量的细胞碎片，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测。

2. 融合筛选及亚克隆

2.1 融合筛选

在检测的前一天，用PBS包被5 ug/ml抗原于ELISA板，过夜。次日吸取细胞上清100 ul/孔进行ELISA检测。根据ELISA结果，判断阳性孔（样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。确定后的阳性孔细胞进行亚克隆。

2.2 亚克隆

吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入N/4 ml DMEM培养基（N为细胞计数结果），取100 ul细胞悬液到离心管中，吹匀后留1 ml，补加DMEM到4 ml，吹匀，留100 ul（约2滴）在管底。在离心管中加DMEM至5 ml，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2 ml左右，补加DMEM至5 ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8 ml左右，补加DMEM至2.8-3 ml左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7-10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。

3. 实验结论

通过2次细胞融合及多次亚克隆实验，最终获得了针对莫西沙星-OVA有较高特异性的单克隆阳性细胞2株，但竞争效果不明显，下一步计划再尝试做最后一次细胞融合实验。

六、第三阶段实验

1. 融合筛选

1.1 融合筛选结果

选取效价较高的3#小鼠进行细胞融合，经ELISA筛选阳性克隆结果如下：
包被抗原： 莫西沙星-OVA
包被浓度： 0.1 ug/ml, 100 ul / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
二抗： 山羊抗鼠-HRP，1/5000

1.2 亚克隆细胞定株后检测结果

选取10株阳性融合细胞进行亚克隆实验，经ELISA筛选后定10株结果如下：
包被抗原： 莫西沙星-OVA
包被浓度： 0.1 ug/ml, 100 ul / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)

2. 单克隆细胞上清竞争ELISA检测结果

包被抗原： 莫西沙星-OVA小分子抗原
包被浓度： 0.1 ug/ml, 100 ul / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
竞争小分子：莫西沙星游离小分子，1 ug/ml起始，3倍稀释

3. 结果分析

通过第3次细胞融合及亚克隆实验，最终获得了针对莫西沙星-OVA有较高特异性的单克隆阳性细胞10株，选择6株长势较快且与莫西沙星游离小分子竞争效果明显细胞株进行定株实验，安排1H4、2G5细胞株进行腹水制备，下一步计划安排腹水纯化及抗体竞争ELISA检测实验。

七、第四阶段实验

1.腹水制备

1.2 腹水ELISA效价检测

具体操作如下：

（1）根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。

（2）包被：用PBS包被液将莫西沙星-OVA检测抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100 ul，4℃冰箱过夜。
包被抗原：莫西沙星-OVA
包被浓度： 0.1 ug/ml，100 ul / 孔
包被缓冲液： 磷酸盐缓冲液 (PBS，pH 7.4)

（3）封闭
包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200 ul封闭液，37℃恒温箱1 h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

（4）一抗反应
1H4、2G5腹水按1/500，2倍稀释，每孔100 ul，37℃恒温箱1 h。

（5）二抗反应
取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100 ul稀释好的酶标二抗，酶标二抗： 山羊抗鼠-HRP，1/5000。37℃恒温箱1 h。

（6）显色
取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100 ul TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15 min。

（7）终止反应
每孔加入100 ul 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450 nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

3. 抗体纯化

将Protein A 琼脂糖凝胶介质装入亲和纯化层析柱，将客户提供的1H4、2G5腹水分别与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4度透析过夜，隔日进行纯度，浓度测定。

4. 抗体鉴定

通过ELISA检测纯化抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定；通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。

4.1 纯化抗体ELISA效价检测

具体操作同腹水效价ELISA检测。

4.2 腹水及纯化抗体效价

具体结果如下：
包被抗原：莫西沙星-OVA
包被浓度： 0.1 ug/ml，100 ul / 孔
包被缓冲液： 磷酸盐缓冲液 (PBS， pH 7.4)
二抗： 山羊抗鼠-HRP，1/5000

起始稀释度: 1:500
效价即样品OD/空白OD >=2.1的最高稀释度

通过ELISA效价检测结果得出，1H4腹水效价在512K左右，纯化抗体效价在128K左右。

起始稀释度: 1:500
效价即样品OD/空白OD >=2.1的最高稀释度

通过ELISA效价检测结果得出，2G5腹水效价在512K左右，纯化抗体效价在128K左右。

4.3 抗体竞争ELISA效价检测

具体操作如下：

（1）根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记

（2）包被：用PBS包被液将莫西沙星-OVA检测抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100 ul，4℃冰箱过夜。
包被抗原：莫西沙星-OVA
包被浓度： 0.1 ug/ml, 100 ul / 孔
包被缓冲液： 磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)

（3）封闭
包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200 ul封闭液，37℃恒温箱1 h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次

（4）一抗反应
莫西沙星游离小分子1 ug/ml起始，3倍稀释，50 ul/孔，1H4、2G5纯化抗体按1 ug/ml稀释，每孔50 ul，空白阴性为莫西沙星小分子10 ug/ml，100 ul/孔，阳性对照为1 ug/ml稀释抗体，50 ul/孔，再加PBST 50 ul/孔，37℃恒温箱1 h。

（5）二抗反应
取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100 ul稀释好的酶标二抗，酶标二抗： 山羊抗鼠-HRP，1/5000。37℃恒温箱1 h。

（6）显色
取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100 ul TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15 min。

（7）终止反应
每孔加入100 ul 1M HCL溶液，终止反应，即刻在酶标仪上450 nm读数。

4.4 纯化抗体竞争ELISA检测结果

包被抗原： 莫西沙星-OVA小分子抗原
包被浓度： 0.1 ug/ml, 100 ul / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
竞争小分子：莫西沙星游离小分子，10 ug/ml起始，3倍稀释；纯化抗体1 ug/ml稀释。

通过竞争ELISA效价检测结果得出，1H4、2G5纯化抗体与莫西沙星游离小分子竞争效果明显。

4.5 抗体纯度鉴定

纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。可见抗体纯化后纯度在85%以上。

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