竞争ELISA法测定抗体亲和力原理

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竞争ELISA法测定抗体亲和力原理

  抗体亲和力是抗体质量的重要指标,它代表了抗体与相应抗原之间的结合力度,亲和力越高,抗体与相应的抗原之间结合强度越高,亲和力是评价抗体质量的重要指标,对于抗体的使用具有指导作用。

竞争ELISA法测定抗体亲和力原理

  抗原与抗体的结合反应最终会处于一个平衡的状态,这种状态可以表示为:
A+G← →A*G
A代表抗体
G代表抗原
AG代表抗原与抗体的结合物

  抗原与抗体的反应是一个可逆的过程,当平衡体系中任何一个物质的量发生变化,或者反应条件发生变化,该平衡状态会被打破,并在新的条件下形成新的平衡状态。例如,当平衡体系中抗原或者抗体的量减少时,抗原抗体结合物会解离形成新的游离抗体和游离抗原,达到一个新的平衡状态,这样的反应可以用平衡常数加以描述:

代表抗原与抗体的结合过程中的结合常数,ka值越高,抗体的亲和力越高。

代表抗原-抗体复合物解离过程中的解离常数,kd值越高,抗体的亲和力越低。
[A]为平衡体系中抗体的浓度
[G]为平衡体系中抗原的浓度
[AG]为平衡体系中抗原-抗体复合物的浓度。

  通过平衡状态测定抗体的亲和力,当抗原为单价,抗原与抗体充分反应达到平衡后,抗原与抗体均会减少相同的量,因此抗原-抗体结合常数可表示为:

A0代表反应体系中抗体初始浓度
G0代表反应体系中抗原初始浓度

  实际情况下抗原一般为多价,只有抗原的量极大,抗体的量很少,才能使一个抗原结合多个抗体的几率很小,因此实际测定亲和常数时,需要使反应体系中抗原的量远远高于抗体量。

  根据以上结合常数计算原理,只需测得平衡状态下抗原-抗体复合物的浓度[AG]值,即可得出结合常数Ka的值,测定抗原-抗体反应平衡体系中相关物质浓度的方法有很多,如平衡透析、离心、高效液相色谱和毛细管电泳等。通常需要设置不同浓度的抗原或者抗体,通过一系列不同浓度的抗原或者抗体反应获得的复合物的浓度,计算获得的结合常数Ka才是具有统计学意义的值,更符合实际情况。

  相较于测定免疫复合物浓度的方法,酶联免疫吸附(ELISA)法检测抗体亲和力简便可行,检测结果比较能反应抗原-抗体结合强度真实情况,因此被应用地较为广泛。

  竞争ELISA法测定抗原-抗体亲和力原理:

  反应平衡状态下

[AG]为平衡体系中结合抗体的浓度
[A]为平衡体系中抗体的浓度
[A0]为初始抗体浓度
[G]为平衡体系中抗原的浓度
[G0]为初始抗原浓度

  平衡状态下抗体结合率
  平衡常数

[A0]为初始抗体浓度
[G0]为初始抗原浓度
a0和ai分别为反应体系中不加抗原和不同浓度抗原反应后ELISA测得的OD450值。

  采用竞争ELISA法检测抗体亲合理结合常数需要注意:
  反应混合物中抗原的量需要远大于抗体量,并且包被的抗原的量不能过多,以免包被抗原与反应混合物中游离抗体结合过多导致平衡体系被破坏,若包被抗原的量过多,会导致测得的结合常数偏小。

  竞争ELISA法测定抗体亲和力方法:
1. 将抗原稀释后4℃包被过夜,封闭液封闭后,4℃放置备用;
2. 设计反应体系,反应体系中抗体浓度一定,抗原浓度梯度稀释,将抗体加入到梯度稀释后的抗原中,使反应总体积为100ul,孵育反应;
3. 将反应混合物加入到包被抗原的反应板中,以每孔100ul双孔加样,孵育反应;
4. 去除反应液,PBS洗涤,加入100ul酶标二抗,孵育反应;
5. 去除反应液,PBS洗涤,加入100ul显色液,显色15min;
6. 每孔加入100ul终止液,终止反应,即刻在酶标仪上OD450读数
7. 将测得的OD450值与抗原和抗体原始浓度值带入公式中计算Ka值,
  由于反应体系中抗体的量远远少于抗原的量,可以直接用抗原的初始浓度G0对C/(1-C)做图,求得的斜率即该抗原抗体的结合常数Ka。

  反应体系设置: