蛋白质双向电泳

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本文介绍了蛋白质双向电泳的原理,详细的实验流程以及实验注意事项,有不对的地方,还请斧正。

蛋白双向电泳原理

  双向电泳(two-dimensional electrophoresis)技术是等电聚焦和十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳技术的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照蛋白质等电点对蛋白质进行分离),然后再进行SDS-PAGE凝胶电泳(按照蛋白质相对分子量大小对蛋白质进行分离),最后经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

蛋白质双向电泳

  等电位聚焦(Isoelectric focusing)是一种根据分子携带的电荷不同来分离分子的技术。蛋白质同时具有酸性基团和碱性基团,在ph值低于等电点时会带有正电荷,在电场中向阴极移动(高于等电点则向阳极移动)。将蛋白质置于有递增ph梯度的凝胶中电泳,蛋白质所带电荷会一直减少,直到蛋白质移动到ph值与其等电点相同的区域。在此处,蛋白质静电荷为0,因此停止运动,最终蛋白质被“聚焦”在ph值和其等电点相同的窄带中

  十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)是一种根据蛋白质相对分子量大小来对其进行分离的电泳技术。十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子去污剂,能够断裂分子内和分子间的氢键,与蛋白质结合后破坏蛋白质的二级结构使其变性,并包覆变性蛋白质,使蛋白质所带负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量,从而消除不同蛋白质间的电荷差异和结构差异,而使蛋白质带有一致的负电荷和一致的形状。此时,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子量,而与所带电荷和分子形状无关。

蛋白质双向电泳实验流程

1.三氯乙酸-丙酮沉淀法提取蛋白

2.双向电泳分离待测样品

(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL,否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。
(2)等电聚焦完毕后(约需24hr),若不立即进行第二相电泳,胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。
(3)等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后,于电泳仪上用12.5%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5W/胶 45min,15W/胶 5-8hr,20℃。

3.银染法对凝胶进行染色

(1)固定:凝胶于含5%冰乙酸和40%甲醇的溶液中过夜固定。也可于含10%冰乙酸和40%甲醇的溶液中慢慢摇晃固定15min。
(2)清洗:凝胶置于35%乙醇中缓慢摇动清洗3次,每次20min。
(3)增敏:凝胶置于0.02%的硫代硫酸钠中增敏2min。
(4)清洗:用去离子水清洗3次,每次5min。
(5)染色:加入0.25%硝酸银溶液染色20min。
(6)清洗:用去离子水清洗2次,每次1min。
(7)显影:用2.5%Na2CO3溶液迅速冲洗,至溶液呈暗黄色;之后用含2.5%Na2CO3和0.04%甲醛的水溶液显影。
(8)定影:用1.46%EDTA定影10min。
(9)水洗:去离子水洗3次,每次10min,然后将凝胶置于1%乙酸中于4℃保存。

3.凝胶扫描及图像分析

(1)图像扫描:凝胶染色后采用Image scanner以300dpi,16-bit模式(65536灰阶)进行扫描。

(2)图像分析:扫描完毕后,凝胶继续置于1%乙酸中于4℃保存。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以最小点面积30,平滑度2为主要参数最大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势,目标蛋白质相邻位点的相对一致性,至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。

蛋白质双向电泳实验注意事项

1.TCA:TCA有毒性,有刺激性气味,损害呼吸道、眼睛及皮肤,称量时应戴手套及口罩,避免沾到皮肤及吸入,若不慎接触,应立即用大量水冲洗后就医。TCA易潮解,称量时应迅速。

2.PMSF:PMSF有剧毒,严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,称量时应戴手套及口罩,避免沾到皮肤及吸入,若不慎接触,应立即用大量水冲洗后就医。PMSF溶于异丙醇后置于-20℃长期保存,保存中易析出结晶,用前取出待结晶溶化后再使用

3.甲醛:有刺激性气味,易挥发,其蒸汽强烈刺激粘膜、眼睛,具有致癌性。使用时应戴手套及口罩,在通风橱内操作。

4.甲醇:有毒,能引起失明。DTT:很强的还原性,散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收危害健康。当使用固体或高浓度储存液时,戴手套和护目镜,在通风橱中操作。beta-巯基乙醇:可致命,对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害。丙酮:对神经系统有麻醉作用,并对黏膜有刺激作用。

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