蛋白质双向电泳常用溶液配方

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   本文介绍了蛋白质双向电泳实验中常用的溶液配方,包括水化/上样缓冲液、溴酚蓝储液、胶条平衡液贮存液、10%(v/v)SDS溶液、4x分离胶溶液、聚丙烯酰胺单体贮存液、10%过硫酸铵、电泳缓冲液、琼脂糖封胶液等9种溶液配方,现与大家分享,欢迎收藏

A.水化/上样缓冲液(rehydration/sample lysis buffer)

水化/上样缓冲液(I) 1ml

urea 8M 0.48g
CHAPS 4% 40mg
DTT 50~65mM 7~9.8mg
or TBP 2mM 10µl
40% Bio-Lyte 0.2%(w/v) 5µl
1%溴酚蓝 0.001% 1µl
MilliQ水   650µl

水化上样缓冲液(II)1ml

urea 7M 0.42g
thiurea 2M 0.152g
CHAPS 4% 40mg
DTT 50~65mM 7~9.8mg
or TBP 2mM 10µl
40% Bio-Lyte 0.2%(w/v) 5µl
1%溴酚蓝 0.001% 1µl
MilliQ水   650µl

  1. 水化上样缓冲液(I)中的尿素浓度可以调高到9或者9.8M;用7M Urea和2M Thoiurea溶解蛋白的能力较单用尿素强。

  2. 目前常用的去垢剂为CHAPS,也可用Triton X-100、NP-40等代替。

  3. 可以加蛋白质酶的抑制剂和/核酸酶。

  4. 还原剂可用DTT或TBP,分离碱性蛋白时最好用TBP。

  5. 5溴酚蓝作为指示剂,可以监测上样和聚焦过程,如操作熟练,可以不加。

B.溴酚蓝储液

  Final concentration Amount
Bromophenol blue 1% 10mg
Tris-base 50mM 6mg
MilliQ H2O   to 1ml

C.胶条平衡液贮存液(SDS equlibration buffer)

(50mM Tris-cl pH8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 2% SDS, bromophenol blue, 200ml)

  Final concentration Amount
1.5M Tris-cl,pH8.8 50mM 6.7ml
Urea (Fw 60.06) 6M 72.07g
Glycerol(87% v/v) 30%(v/v) 69ml
SDS(Fw 288.38) 2%(w/v) 4.0g
1%Bromophenol blue solution 0.002%(w/v) 400μl
    To 200ml

分装后贮存于-20℃;溴酚蓝可以不加;

用之前在加DTT(20mg/ml)或者碘乙酰胺(25mg/ml)

D.10%(v/v)SDS溶液

SDS(Fw 288.38)      10.0g

MilliQ H2O      To100ml

用0.45微米的滤纸过滤室温保存(高纯试剂一般不用过滤)

E.聚丙烯酰胺单体贮存液(Monomer stock solution)

  Final concentration Amount
Acrylamide 30% 150g
N,N’-methylenebisacrylamide
or PDA
0.8% 4.0g
5.0g
MilliQ H2O   To 500ml

用0.45微米的滤纸过滤(可不过滤), 4℃避光保存

F.4x分离胶溶液(4x Resolving gel buffer, 1.5M Tris-Cl pH8.8)

  Final concentration Amount
Tris-base(Fw 121.1)
MilliQ H2O
HCl(Fw 36.46)
1.5M 181.5g
750ml
Adjust to pH8.8
MilliQ H2O   To 500ml

用0.45微米的滤纸过滤,4℃保存

G.10%过硫酸铵

  Final concentration Amount
Ammonium persulphate(APS)
MilliQ H2O
10% 1g
To 10ml

当加入水时,新鲜的过硫酸铵会发出“咔嚓”声音。如果没有声音,则需要换新的药品。可少量(10ml)配制,分装后4℃保存。

H.电泳缓冲液(TGS electophoresis buffer)

(25mM Tris,192 mM glycine, 0.1%SDS)

Final concentration   Amount
Tris base 25 mM 15.1g    7.55g
Glycine 192mM 72.1g    36.05g
SDS 0.1%(w/v) 5.0g    2.5g
MilliQ H2O   To 5000ml
To 2500ml

该溶液的pH值不需调整,可直接在大试剂瓶中配制溶液,室温保存。

I.琼脂糖封胶液(Agrose sealing solution)

  Final concentration Amount
TGS electophoresis buffer
Agrose (NA or M)
1% Bromophenol blue
---
0.5%
0.002%(w/v)
50ml
0.25g
100μl

可在锥形瓶配制,微波炉加热熔化。小份分装,室温保存。