质粒转染操作步骤与注意事项

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  质粒转染是哺乳动物细胞蛋白表达和昆虫细胞表达中至关重要的一步,转染的效率直接影响着整体实验的成败,本文阐述了昆虫细胞扩P1转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染的具体操作步骤与实验体系,同时附有一些我们整理的提高质粒转染效率的注意事项,供大家参考。

实验室实拍

1、昆虫细胞扩P1转染:

(1)取细胞状态良好,活力98%以上,对数生长期细胞铺六孔板,90万/孔;
(2) 27°静置培养30 min,待完全贴壁后进行转染;
(3)转染体系

转染缓冲液 质粒 转染试剂(lipo2000)
200 ul 10 ug 10 ul

注:先将质粒加入到转染缓冲液里,再加转染试剂

(4) 室温孵育30-45 min;
(5) 孵育好之后滴加到预先铺好的六孔板中;
(6) 4-6天后收集上清即为P1代病毒;

注:质粒室温预热,转染试剂和培养基37度预热

2、293细胞小试转染:

(1)前一天取细胞状态良好,活力98%以上,对数生长期细胞稀释至1x10^6 个/ml;
(2) 转染当天细胞计数1.8-2.2 x10^6 个/ml细胞状态良好,活力98%以上方可转染;
(3)转染体系

转染体积 缓冲液 质粒 转染试剂(PEI)
90 ml 10 ml 100 ug 300 ul

(4) 充分混匀后37度孵育20 min;
(5)孵育好后倒入预先分好的细胞中,摇晃均匀后放37度培养;
(6)第二天添加TN13 ml/100 ml;
(7) 4- 6天后收集上清或细胞做下游实验,胞内表达4天收,胞外表达6天收,5000 rpm 10 min,上清沉淀分开保存;

注:转染过程中一个实验一个滤器一个离心管,完全独立,避免交叉污染;质粒室温预热,转染试剂和培养基37度预热

3、ExpiCHO细胞转染:

(1)前一天取细胞状态良好,活力98%以上,对数生长期细胞稀释至3-4 x10^6个/ml;
(2) 转染当天细胞计数7-9 x10^6个/ml细胞状态良好,活力98%以上,将细胞稀释至6 x10^6个/ml;
(3)转染体系

转染体积 缓冲液OPI 质粒 转染试剂专用
25 ml 75 ml 25 ug 75 ul

注:先将质粒加入到转染缓冲液里,再加转染试剂;质粒常温预热,转染缓冲液和转染试剂4度使用即可

(4) 充分混匀后室温孵育1-5 min;
(5)孵育好后倒入预先分好的细胞中,摇晃均匀后放37度培养;
(6)第二天添加Enhance150 ul Feed 6ml;
(7)8-10天后收集上清或细胞做下游实验;

注:转染过程中一个订单一个滤器一个离心管,完全独立,避免交叉污染

4、质粒转染中一些注意事项

(1).细胞密度

  细胞铺板与转染最好当天进行,一般来说,当细胞密度达到70%~90%时进行转染可以取得较高的转染效率,过低或过高都会影响转染效果。

(2)细胞状态

  这点是核心,很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此,为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性,应尽量使用适度传代的细胞系,并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。传代尽量保证细胞分布均匀、密度合适,如果有细胞分布不均导致聚集成团或传代密度太大细胞连成一片,则单个细胞与培养液的接触面积减少,脂质体进入细胞的几率下降,导致质粒转染效率低下。
  其次,尽量选择无支原体污染的细胞,支原体污染是无法通过视觉检查发现的,严重影响着质粒转染效率,可以改可用支原体检测试剂盒进行检测,确保无支原体污染。

(3).细胞种类

  不同细胞种类的细胞在做转染时所需要的转染体系是不同的,不能一种体系用在所有类型细胞的转染实验。 如上所示,针对昆虫细胞转染、293细胞小试转染、ExpiCHO细胞转染我们分别使用了三种不同的转染体系。

(4)DNA纯度

  在制备高纯度DNA时,还需要对DNA进行内毒素的去除,内毒素的存在会造成细胞毒性,严重影响转染效率,因此我们在做质粒转染时,对交付的质粒有如下要求:交付的质粒使用TE溶解(10 mM Tris-HCl,1 mMEDTA), A260/A280比值在1.8-2.0之间,质粒浓度在1000 ng/ul左右
①内毒素小于0.128 eu/ug
②质粒大抽要求:无内毒素、无苯酚、无氯化钠
③质粒需经过跑胶鉴定,超螺旋质粒含量大于50%,无明显蛋白污染

(5).转染试剂

  转染试剂的原则是高效、低毒、方便、廉价,每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。

总之,质粒转染虽然是基础性的实验,但是要想做好还是要花不少的心思,钟鼎生物愿意与广大科研工作者交流实验的心得体会,欢迎咨询