测序蛋白纯化实验步骤及注意事项

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    蛋白质纯化的目的除了研究蛋白质特性以外,也经常用于蛋白质测序,本文主要介绍用于测定氨基酸序列的蛋白质纯化过程中一些注意事项以及经常在测序前所采用的纯化技术。

蛋白表达与纯化实验室

1.蛋白纯化步骤

1.1透析:水透析在许多情况下是很有效的。有些固相测序过程中,0.1%~0.25%的SDS与蛋白质一起保留在溶液中不会对测序产生不利影响 (而实际上可能有助于蛋白质与树脂的结合)。如果要求除去SDS,通常可以通过20%~30%乙醇或2-丙醇透析来完成。对于含量少于1nmol的样品,除非采用一些微量透析系统,一般不用透析。气相或液相脉冲仪也应避免使用SDS。

1.2反相色谱:Sep-Pak试剂盒对此方法比较有效,而且操作简便。蛋白质吸附到树脂上,而盐和杂质可水洗除去,再用乙腈或甲醇回收蛋白。
    反相HPLC对于得到纯样品是一种非常有效的方法。有机溶剂(特别是高纯度乙腈)加入0.01%~0.1%三氯醋酸效果很好,样品可通过冻干除去溶剂(注意再溶解时溶液可能呈酸性)。如果蛋白质可被低离子强度溶液洗脱,疏水色谱对于除去两性电解质、多缓冲体系和盐类也是非常有用的。

1.3有机溶剂沉淀:对于清洗样品,用10~20倍体积冰丙酮,或5~10倍体积冰乙醚,或醚-醇混合液 [体积比 (1:1)~(3:1)]沉淀和洗涤也是一种快速有效的方法,特别是要求除去去污剂时,不建议使用三氯醋酸。

1.4凝胶过滤色谱:利用Sephadex G-10和G-25或者 Biogel P-2和P-4以1%~5%的醋酸或甲酸溶液脱盐也是一种有效的方法。当体系中含有膜蛋白和/或去污剂,而通常又需要将这些物质作为单体保留在溶液中时,可以将甲酸-醋酸-氯仿-甲醇 (体积比1∶1∶2∶1)混合液加入到 Sephadex LH-60 和 LH-20 树脂中。一般不允许加热干燥这些溶液中的样品,否则会导致过多的N末端甲酰化。
    此外,HPLC凝胶渗透柱,比如 TSK 系列 (Anachem,Beckman,Pharma-cia-LKB公司)或者GF-系列 (DuPont公司)也可以采用。一般最好避免采用凝胶过滤,除非蛋白质或多肽数量为纳摩尔级。

1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):除去少量污染物,特别是大分子物质的一种快速有效的方法是进行十二烷基硫酸钠 (SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以及电洗脱或电渗析等。为避免阻断N末端,使用高品质的试剂配制凝胶尤为重要。一般应使用电泳级试剂(如 BDH),理想的 SDS应在温水溶液中重结晶。电泳缓冲液中加入0.2mg/ml的硫乙醇酸也有作用。
    简单的电洗脱操作程序不需要复杂的设备,方法如下:
① 考马斯亮蓝凝胶染色(5-10min)后,于脱色液中漂洗10~15min,直至出现蛋白质条带,为保证收率,染色和脱色时间应该尽可能短。完整切下所需条带。
② 将 缓 冲 液 [25mmol/L Tris-甘氨酸,pH=8.5,0.1% (1g/L)SDS;50mmol/L Tris-醋酸,pH=7.8,0.1%SDS;0.1mol/L 碳酸氢钠,pH=7.8,0.1% SDS或0.1 mol/L 磷酸钠,pH=7.8,0.1% SDS]加入到平板电泳槽中,液面高出凝胶架大约1cm。如需要,缓冲液中可加入0.1% (体积分数)的2-巯基乙醇或2~5mmol/L的二硫苏糖醇。对于膜蛋白,缓冲液的 SDS浓度可以提高到1% (10g/L)以确保溶解。
③ 取长度足以装入凝胶切片的透析袋,一端留出约2cm,用夹子夹住,将电泳槽中的缓冲液加入袋中。凝胶切片放入袋中 后,封口前轻轻挤出大部分液体。将凝胶切片置于透析袋一端。注意避免带入气泡。
④ 将透析袋置于电泳槽凝胶架上。调节缓冲液液面,使其恰好淹没透析袋。25~100V 直流 (20~150mA)电泳3~20h,然后反向电泳大约30s (以便使聚于透析膜表面的蛋白质脱离透析膜)。
⑤ 将凝胶切片从透析袋中除去。重新染色检查蛋白质是否被洗脱。所有残留的小凝胶片段也必须除去。通常将清液转移,离心或者过滤以去除所有残片。
⑥ 透析袋重新封口,将蛋白质溶液在蒸馏水中透析数遍,透析液可含最多0.25% (2.5g/L)的SDS,以保持蛋白质溶解,但仅限于最后一次蒸馏水透析。考马斯亮蓝染料应与蛋白质充分接触后才可作为电洗脱的指示剂。

    对于固相蛋白测序仪,蛋白质可以从凝胶上直接电泳转移到衍生化玻璃纤维纸或聚二氟乙二烯 (PVDF)上。未预先活化的 PVDF膜可用于气相仪。转移后的蛋白质经考马斯亮蓝或荧光染料显影,将显色斑或显色条带切下后可直接放入测序仪中。

2.注意事项

    有关文献所描述的蛋白质和多肽的纯化方法一般都涉及手工或自动序列分析。当制备测序用蛋白样品时,需要注意以下一些问题,这些限制因素更多的可能与Edman降解测序法有关,而FAB质谱法也有其自身的污染等问题。

    污染物主要来源于试剂中的多种小分子有机和无机化合物。为避免杂质对N末端的阻断,整个纯化过程中高品质试剂 (分析纯以上)以及采用温和反应条件是非常重要的。例如,如果尿素溶液中含有氰酸根离子,这些离子会与氨基反应而影响测序,而在高品质的尿素溶液中其含量较低。为了更谨慎起见,尿素溶液应在使用前配制,并经过离子交换树脂纯化。这些树脂均有商品,可由厂商 (如BDH 或Bio-Rad)提供。此外,加入20mmol/L的甲胺可能有助于测序,应避免使用一些会与氨基产生反应的试剂。

  有一些可能会引起污染而应避免的小分子物质,其中含有伯胺的化合物通常是最麻烦的,经常会破坏整个测序分析。在一些利用载体吸附的固相测序中,这类物质会非常有效地与蛋白质和多肽竞争。而在其他自动和手动测序中,它们也会与 Edman降解试剂苯异硫氰酸酯反应,从而导致产率的降低,严重时会产生明显的重叠问题。一般序列重叠是由一次测序反应循环期间的部分反应引起的,这样从此次循环之后会产生交错的顺序,至少在随后的循环中会观察到两个相同的氨基酸。

    最常见的氨基杂质可能是铵盐,特别是碳酸氢铵,该物质通常认为可通过冻干法完全除去,但是许多研究人员发现该方法不能达到完全去除的目的。其他一些应避免使用的常用化合物包括 Tris、嘧啶、甘氨酸、二羟乙基甘氨酸、氨基糖、多缓冲体系、两性电解质以及大多数的去污剂。虽然测序(特别是利用固相法测序)仍然要在这些物质存在的条件下进行,但污染的存在严重降低了测序程序的有效性。如果用 FAB-质谱分析样品,应该除去大多数盐,因为它们可能会与甘油以及常用于该技术的载体形成所不希望的加合物。大分子污染物 (如磷脂、碳水化合物和核酸)一般较少遇到,但是它们也会带来特定的问题,必须将其去除。

以上便是测定氨基酸序列的蛋白质纯化过程中一些注意事项以及经常在测序前所采用的纯化技术。但是由于种种原因,经常要将蛋白质转变为多肽用于测序,这边就要介绍多肽的制备与纯化