测序多肽的制备与纯化

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    由于多种原因,蛋白质不能满足测序的需要,经常要将蛋白质转变为多肽用于测序,本文就将介绍多肽的制备与纯化。

蛋白表达与纯化实验室

    对于需要将蛋白质转变为多肽用于测序,这里举一个例子,就是在制备基因克隆 DNA 探针的序列信息时,含有甲硫氨酸或色氨酸的多肽可能就非常有用,因为这些氨基酸只由一个三联体碱基密码所编码。含色氨酸的多肽可在280nm 吸光度下检测。理想情况下,色谱洗脱液可用双通道检测器(设定为220nm 和280nm)或二极管检测器 (测定各峰的吸收光谱)检测。含甲硫氨酸的多肽可用氨基酸分析或特定标记测定。30个氨基酸残基以内的多肽需要用FAB质谱以得到较好的测序结果。制备和纯化这类多肽的常用方法如下文所述,也可参见有关文献。

    对于制备分子量较小的多肽有许多方法,首先要使蛋白还原并且不可逆修饰所有的半胱氨酸残基。这样可防止二硫键的形成或交换,有利于随后测序中半胱氨酸的确定 (未修饰的半胱氨酸会转变为难以检测的产物)。通常使用的试剂包括碘乙酸和2-乙烯吡啶。还原和巯基修饰的方法:将蛋白质溶解于不超过1ml的6mol/L氯化胍或含8mol/L去离子尿素的0.5mol/L的 Tris-HCl,pH=8.0~8.5,1mmol/L EDTA 的溶液中,也可加入不超过1%的SDS以保证蛋白质的溶解。加入10μl的2-巯基乙醇或 DTT,浓度达到10mmol/L,N2环境暗室20~35℃保温1~3h。加入无色碘乙酸或碘乙酰胺 (250mg/ml溶于0.1 mol/L NaOH溶液,体积不超过0.1ml)或4-乙烯吡啶 (25mmol/L 乙腈溶液),N2 环境暗室室温分别保持20min。丙酮沉淀,透析,凝胶过滤回收蛋白。

用于制备小分子多肽最常用的方法是:
①在甲硫氨酸残基后溴化氰化学裂解;
②在赖氨酸或精氨酸残基后利用胰蛋白酶,或谷氨酸残基后利用Staphylo-coccus aureus V8内切蛋白酶 Glu-C酶法降解。还有一些其他的化学方法和酶法降解。

    利用各种酶,如内切蛋白酶 Arg-C、Asp-N、Glu-C以及 Lys-C进行有限的蛋白质降解,可以得到N末端阻断的蛋白质序列数据(下表) 。含有最多1%SDS的电洗脱蛋白液可以进行蛋白质降解,该方法可与 SDS-PAGE 联用。降解后得到的多肽通过SDS-PAGE分离回收。

试剂 条件
内切蛋白酶Arg-C 100mmol/L NH4HCO3溶液,20~37℃保持8h。冷冻,煮沸或加入10mmol/L的PMSF终止降解反应
内切蛋白酶Asp-N 50 mmol/L磷酸钠,pH8.0溶液,20~37℃保持18h。可含有最多1mol/L 尿素,1mol/L氯化胍或0.01% SDS
内切蛋白酶Glu-C 同Arg-C,最多可含0.5% SDS
内切蛋白酶Lys-C 同Arg-C,最多可含0.1% SDS
胰蛋白酶 同Arg-C
溴化氰(CNBr) 70% HCOOH 溶液,最多可比 Met过量1000倍,N2 环境室温暗室保持24h。旋转蒸发终止反应(注意:CNBr可形成有毒物质)

    多肽混合物可借助反相或离子交换 HPLC 或 FPLC 得到充分纯化。由于混合物一般比较复杂,通常需要利用几种色谱方法。首先可利用的是离子交换色谱,然后是反相色谱。此外,也可尝试在两个不同pH 条件下的反相色谱。最终的色谱分离 (反相体系)最好是在可挥发的缓冲液中进行,如0.1%的三氟醋酸和乙腈溶液。这样多肽样品就可以利用离心浓缩器进行充分的真空干燥。以少量体积溶液溶解多肽,一般1%的三氟醋酸-乙腈 (50∶50,体 积 比)溶液对大多数多肽都较适合,样品可转移到气相测序仪进行测序。对于固相测序,含有SDS的缓冲液可适用于联用方法。