SDS-PAGE/聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与实验步骤

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  十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)作为聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的一种,可测定蛋白质的分子量,对蛋白质组分进行分离、分析、纯化、定性、定量以及少量的制备。在蛋白表达中有着广泛应用,尤其是在大肠杆菌表达系统中,有着不可替代的作用。

1.SDS-PAGE的类型

  在SDS-PAGE中,由于蛋白质与SDS结合后都带负电,因此是阳极电泳。
  与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳相似,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳也可分为圆盘电泳、垂直平板电泳和水平平板电泳。其中平板电泳较常使用。

垂直平板电泳

  SDS-PAGE一般来说不采用连续电泳方式,因为在SDS-PAGE中蛋白质间不存在电荷密度差异,多采用不连续电泳方式。不连续电泳中蛋白质的分离主要取决于其分子大小和形状。不连续电泳的分离胶可以是均一胶,也可以是梯度胶。

2.SDS-PAGE的原理

  对于SDS-PAGE,由于在电泳体系中加入了十二烷基硫酸钠(SDS)和强还原剂(如巯基乙醇,二硫苏糖醇等),其中SDS作为阴离子去污剂会破坏蛋白质的氢键和疏水相互作用,导致蛋白质构象改变,而巯基乙醇等可以打开蛋白质分子内的二硫键,使其分解为亚基,因此电泳过程中蛋白质的生物活性丧失或减弱,但电泳后可恢复或部分恢复其活性。

  在离子强度低时,主要以单体形式存在的SDS可以与蛋白质结合,生成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷,复合物所带的负电荷远远超过蛋白质原有的负电荷,这使得不同蛋白质间电荷的差异被掩盖。而SDS-蛋白质复合物形状都呈椭圆棒形,棒的长度与蛋白质亚基分子量有关,所以在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白只存在分子大小的差别,利用这一点可将不同的蛋白质分开 (分子筛效应),因此SDS-PAGE常用于检测蛋白质亚基的分子量及鉴定纯度。

与常规PAGE类似,不连续SDS-PAGE对蛋白质的分离除了基于分子筛效应外,还基于其对样品的浓缩效应。

3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法

样品缓冲液中须含有3~4倍于蛋白质的SDS以及足够断裂二硫键的β-巯基乙醇或二硫苏糖醇,而且蛋白须完全变性展开。由于每克伸展的蛋白质结合1.4g单体SDS,因此通常在样品缓冲液中加1%~2%(10~20g/L)SDS,在凝胶及电泳缓冲液中加0.1%SDS。

制胶

SDS-PAGE多采用不连续的电泳方式,其制胶方法与常规PAGE的制胶方法基本一致,但由于凝胶中含有SDS,容易起泡,低温下又易结晶析出,因此单体储备液不需抽气,聚合时的凝胶也不适宜在4℃放置。制胶模具的准备也同常规PAGE相同。下面就介绍不连续电泳中的阳极电泳的制胶方法。

(1)凝胶储备液的配制

① 丙烯酰胺储备液T=30%,C固定,2.6%~3%。
② 4×分离胶缓冲液 如pH=8.8、1.5mol/L Tris-HCl缓冲液,含0.4%SDS。
③ 4×浓缩胶缓冲液 如pH=6.8、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液,含0.4%SDS。
④ 10%过硫酸铵溶液(AP)。

注:丙烯酰胺是神经毒剂,应戴手套操作。电泳时的试剂应达到电泳纯,并使用重蒸水配制溶液。

(2)分离胶配方

A液/ml B液/ml 重蒸水/ml 10%AP/μl TEMED/μl
x/30×10=x/3 10/4=2.5 10-x/3-2.5 约50 3~5

根据聚合的快慢来调节AP和TEMED的用量,使凝胶在20~60min内聚合。

(3)制备浓缩胶

制备样品和加样

5×样品缓冲液:pH=6.8、0.06mol/L (0.4mol/L)Tris-Hcl缓冲液,含25%(50%)甘 油、2%(10%)SDS、5% (体积分数)巯基乙醇和0.1%溴酚蓝。

将蛋白质溶液与5×样品缓冲液以4:1(体积比)的比例混合(如果蛋白质溶液浓度过高,需预先脱盐处理)后,在100℃水浴中加热3~5min,使蛋白质充分变性,再于10000r/min离心5min,取上清加样。

电泳

电泳缓冲液:pH=8.3,0.025mol/L Tris-0.192mol/L Gly缓冲液,含0.1%SDS。

1、带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用很好的并且长期的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,以防止银染时的纹理现象。

染色和检测

(1)考马斯亮蓝法,在SDS-PAGE后,凝胶的固定和染色时间应比常规PAGE的长1倍左右,或用多倍体积染色液染色,以排除SDS的影响。
(2)银染法,在电泳后染色之前,必须将凝胶多次漂洗,以除去SDS。

4.影响分离结果的因素

缓冲系统

在SDS对蛋白质的助溶作用以及负电荷的包裹作用影响下,蛋白质的分离仅依据亚基的分子大小,因此缓冲系统的选择比较简单,只要利于分离并保持蛋白质的稳定以及不与SDS发生相互作用即可。常用的缓冲系统有 Tris-Gly缓冲液,其余如磷酸缓冲液(多用于连续电泳)、Tris-醋酸盐缓冲液、Tris-硼酸盐缓冲液、咪唑缓冲液以及SDS-尿素系统 (用于分离低分子量蛋白样品)。离子强度一般为0.01~0.2mol/L。

SDS-PAGE为阳极电泳,在凝胶缓冲液中加入 0.1%SDS,在样品缓冲 液中加1% ~2%SDS和1%~6%巯基乙醇 (或3%二硫苏糖醇),并加适量溴酚蓝,在电极缓冲液中加0.1%SDS,不连续电泳的凝胶缓冲液和样品缓冲液中还需加适量甘油。

凝胶浓度

由于凝胶浓度决定凝胶孔径大小,而凝胶孔径影响电泳效果 (即凝胶的分子筛效应)。特别是对于SDS-PAGE,由于电泳分离只取决于SDS-蛋白质亚基胶束的大小,因此凝胶浓度的选择尤为重要。应根据样品中蛋白质的分子量范围选择合适的凝胶浓度

C=2.6% C=5%
凝胶浓度(T)/% 分子量范围/kDa 凝胶浓度(T)/% 分子量范围/kDa
5
10
15
20
25-200
10-70
<50
<40
5
10
15
20
60-170
20-100
10-50
5-40