SDS-PAGE/聚丙烯酰胺凝胶电泳的常见问题解析

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SDS-PAGE实验FAQ

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、SDS-PAGE蛋白电泳配胶不凝固怎么办?

(1)可多加过硫酸铵试试
(2)可多加点TEMED来加速凝固
(3)配好胶后放在温箱里凝的快些,环境温度低会影响凝的速度。在冬天灌好胶后放在培养箱里,一般情况下很快就凝了,可以提高效率。
(4)经常出现浓缩胶凝但不成形,非常粘,这是因为C液(浓缩胶缓冲液)的pH值不对,重新配制C液

2、如何提高SDS-PAGE电泳的分辨率??

充分聚合聚丙烯酰胺。

建议:有些同学会即配即用或在4度冰箱放置,一方面易导致凝固不充分,另一方面可导致SDS结晶。待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用,一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。

3、胶聚合速度过慢的原因

重新配了tris缓冲液和acrylamide溶液。最好是定期就重新配制tris缓冲液。

4、样品该怎么处理?

针对样品分离目的的不同,主要有三种处理方法:带有烷基化作用的还原SDS处理、还原SDS处理以及非还原SDS处理。

1、带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用很好的并且长期的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,以防止银染时的纹理现象。

2、还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。这是电泳最常见的处理方式,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。

3、非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般来说只用1%SDS,沸水中煮3分钟,不加还原剂,因而蛋白折叠没有被破坏,不用来测定分子量。

5、SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分分别有什么作用?

1.制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统
2.聚丙烯酰胺的作用:给蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否;
3.TEMED与AP:加速聚丙烯酰胺的凝固;
4.十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,可用来去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用和去多肽折叠。

6、蛋白条带为什么走到下面逐渐变宽发散?

原因:多数是因为小分子在胶里的运动不规律,这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里。
解决:可加大阴极的缓冲液浓度,看是否有改善

7、两边翘中间凹形条带是什么情况?

原因:凝胶的中间部分凝固不均匀,多出现于较厚的凝胶中。
解决:充分凝固再作后续实验。

8、两边向下中间鼓起形条带什么情况?

原因:两板之间的底部间隙气泡没有排净。
解决:可在两板间加入适量缓冲液。

9、跑出来的胶有很多的横着竖着的条带,这是什么原因?

(1).提取蛋白的时候要充分超声粉碎,然后高速离心。吸取上清的时候不要触到沉淀。胶里面很有可能有杂质。

(2). 遇热膨胀过度,可以在电泳槽里面安放冰槽,电泳液预先降温,同时降低电泳时的电流。还有配琼脂也要用缓冲液,而不是水,不然不导电。 接触不好也会引起条带变形

10、“鬼带”是什么,该如何应对?

“鬼带”出现的原因是是跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会在泳道顶端出现的一些未知条带或加样孔底部有沉淀,由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合成大分子,往往其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。

解决:在加热煮沸后,再添加适量的还原剂或加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

11、为什么电泳的条带很粗?

原因:很正常,主要是未浓缩好的原因。
解决:保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当增加浓缩胶的长度;适当降低电压;