规模化蛋白质纯化

  ◎当前位置:首页>>技术服务>>重组蛋白表达服务>>规模化蛋白质纯化

  规模化纯化蛋白质的关键因素在于产量和成本,纯化过程应尽可能精简,避免人为因素干扰。进行规模化纯化蛋白质时,已经基 本了解目的蛋白、原料、生产方法、产品纯度要求和最终数量等,但是纯化过程 中很多方面可能要重新评估并作出适当的改变。从实验室规模纯化蛋白质向工业 化规模纯化生产蛋白质的扩大,属于工程学的范畴。工厂规模是一次性的,它必 须成功。

  以下介绍规模化纯化蛋白质所需遵循的原则,规模化操作过程和优化控制, 以及规模化纯化中遇到的在实验室操作中可能被忽略的问题。

实验室实拍

1.基本原则

  (1)合理设计实验方案,在规模化纯化蛋白质过程中,主要步骤通常不超过4-5个。要尽可能多的了解目的蛋白和杂质的物化性质,尽可能早使用高选择性的步骤,尽可能早分离除去数量最多的杂质,在分离纯化的早期一般是浓缩蛋白质并除去水;最后执行特别费时间或成本很高的步骤。:
  (2) 选择适当的发酵系统和发酵条件,发酵过程和蛋白质分离纯化过程是相互影 响的,合适的发酵将有助于发酵产品的分离及蛋白质的纯化。要严格控制、防止 蛋白酶和细菌的污染。
  (3)规模化纯化蛋白质时,还要注意保持蛋白质活性,减少蛋白质变性及失活。选择适 当的操作温度 (尽量在低温下进行操作)、pH 和泵,可以有效地控制蛋白质的变性。为了避免因为肽酶的作用等因素造成蛋白质降解,要保持比较低的浓度,尽量缩短操作时间。随着规模的扩大,样品溶液浓度要逐步递增,以减少对色谱过程的影响。
  (4)保持清洁和卫生。即使是低水平的微生物污染也会造成很大的麻烦:过滤机、色谱柱寿命的缩短,产品稳定性的降低等。因此,所有设备都要定期进行严格的清洁和卫生工作。

2.主要操作过程

2.1细胞分离

  工业用离心机通常设计成连续进料。细胞在离心机中沉淀越快,在转子中的 保留时间就越短,相应地,离心处理量越大。决定离心机容量的一个主要因素是相关粒子的大小。通过离心操作回收酵母已有很多年,而动物细胞的处理更加复 杂,因为它们很容易破裂,当通过离心系统时,可能会分解产生微小的碎片。大规模分离细菌和细胞碎片最常用的离心机是多层转盘离心机。

  过滤技术(深层过滤,微孔过滤,超滤)常用于固液分离。旋转式真空过滤机是比较常见的一种,已应用于大规模生产酶制剂过程,从发酵液中除去细菌菌体或丝状微生物。膜过滤系统越来越多应用于规模化从发酵液中分离细胞和细胞碎片,在无菌分离的效果方面远好于价格昂贵的离心机。然而,膜过滤的主要缺点是不能处理高浓度细胞,高浓度细胞会明显降低过滤速度。微滤能够截留溶液中非蛋白质的微小物质,而超滤能够截留溶液中的蛋白质。

2.2. 细胞破碎和碎片分离

  对于细胞内蛋白质的分离,需要先有效破碎细胞。通常先收集细胞,然后进行洗涤以除去残留的培养基,对于仅仅由细胞膜包围着的细胞,比如哺乳动物细胞,破碎比较容易,如果存在聚合细胞壁结构(比如微生物细胞),破碎时就会困难些。以下是三种规模化破碎细胞的方法比较。

方法 优点 缺点
均质法 产量可达6000L/h 不适用于高等真菌,产热高容易使蛋白变性、容易污染
研磨法 产量可达2000L/h,适用于细菌与酵母细胞 破碎效率不稳定、容易污染
酶解法 条件温和,损失较少 条件摸索复杂,成本较高

2.3.浓缩

  早期纯化阶段需要将蛋白质溶液浓缩10-50倍,以减小过程体积并使随后的操作更容易处理,这在规模化纯化蛋白质时是个重要的必不可少的步骤,超滤 是比较合适的技术,一般采用错流系统。

2.4.色谱分离

  采用色谱技术从粗产品中分离纯化蛋白质,在生产中始终都要慎重操作。经过浓缩后,得到了蛋白质、其他成分(比如类脂物、细胞壁或其他多糖类)、盐 和水的混合液,随后一般经2~4步色谱纯化才能达到所要求的蛋白质纯度。可 以从不同的色谱方法中进行选择,实验室实验结果有参考作用,专家系统也有助 于优化蛋白质纯化的顺序。首先采用典型操作 (如吸附、双水相萃取或盐析沉淀 等)来提高收率,减少纯化步骤,然后采用高效液相离子交换色谱或亲和色谱纯 化蛋白质,得到99% (通常情况下95%~98%)纯度的产品。经过上述步骤之 后,如果有需要,可进一步采取其他方法以获得超高纯度。

  在设计规模化色谱操作时,要保证色谱过程可以重复,安全性好,能满足卫 生要求,色谱操作过程、设备、环境、厂房的设计也能保障整个操作环节的卫生 要求及安全性,同时方便于色谱过程数据的收集。通常需要综合考虑以下几个因素:操作过程和装置的控制及可靠性,卫生条件的维持,固定投资费用及操作成本等。

  在大规模色谱分离时,由于样品的体积很大,加样时间常常很长,成为分离 过程的限制性因素,此时往往可以采用分批分离的方法,即吸附过程甚至吸附和 解吸过程都不在色谱柱中进行,样品在容器中与离子交换剂充分混合完成吸附, 将上清液除去,然后将吸附了蛋白质的离子交换剂装柱并进行洗脱,或者直接在容器中用阶段洗脱的方法进行洗脱,此方法可以大大提高分离速度,当然也会使 分辨率变低,适合在规模化分离的前期使用。
  离子交换因其具有很高的样品吸附容量,不但在实验室分离中广泛被使用,而且适合于规模化的蛋白质纯化。离子交换剂具有从稀溶液中浓缩蛋白质的能力,也适合于从大体积的样品(如发酵液)中纯化所需蛋白质。对于实验室小规模的制备,体积为500ml的色谱柱基本能够满足需要,而在工业化应用中,色谱柱的体积可以被放大到100~200L。由于分离的原理和过程是一致的,很明显,根据已经优化好的小规模分离条件,结合放大时的容量因子,可以推测出大规模分离时所需的操作条件。
  放大过程中的原则是,保持色谱操作上样、吸附和洗脱的条件不变,这里包 括样品的组成、离子交换剂的种类、样品介质比(mg蛋白/ml离子交换剂)、起始和洗脱缓冲液的组成、pH和离子强度 等,在此基础上根据样品量放大柱体积、洗脱剂的体积、流速等参数。其中柱体积是随样品体积的增大而线性增大的,并且柱体积的增大主要通过选用内径大的色谱柱来实现,柱高一般不宜有太大的增加,否则会造成分离时间的增加和样品峰宽的加大。至于洗脱剂的体积, 无论采用哪种洗脱方法,也都是随样品体积增加而增加的。色谱操作时的流速有 两种常用的表示方法,即线性流速(cm/h)和体积流速(ml/min)。一般在讨论 离子交换剂的流速特性和动力学时采用线性流速,而在实际操作过程中通过泵直 接调节控制的是体积流速。它们之间的换算关系为:体积流速 (ml/min)=线性 流速(cm/h)×色谱柱截面积(cm2)/60。在放大过程中应保持线性流速不变,而体积流速将随色谱柱截面积的增大而增加。
  以上是基于很多参数不变的前提,但实际上,大规模纯化中有些参数很难做到完全不变,比如样品的成分和样品介质比。通过发酵、动植物细胞培养或者从生物原料提取目的蛋白时,每一批次的样品在组成、总蛋白含量、目的蛋白所占比例等很多方面总是有一定的波动,这会造成色谱柱内离子交换剂上实际吸附的 蛋白数量和组成每次都有所不同,这往往会导致分离的效果发生改变。特别是大规模分离时样品介质比往往较大,就是说,离子交换剂的交换容量已经被利用到很高的程度,此时样品中蛋白质组成和含量发生变化,可能会造成目的蛋白不能 被完全吸附,因此放大过程中,在有效交换容量上应留有一定的余地。大规模分 离中使用的离子交换剂应当具有良好的物理和化学稳定性,基质颗粒通常不宜太小,因为基质粒度的大小与色谱柱内的背景压力直接相关,相同的粒度情况下, 颗粒直径分布均匀有利于保持相对较低的背景压力。另外,由于大规模分离时交换剂用量很大,必须考虑介质的成本。
  在大规模分离中采用的是直径很大的色谱柱,此时如果将样品或缓冲液直接加到交换剂的床面上,是很难保证液流能均匀进入柱床的,所以在柱床的上方设计一个液流分配器,以便采用多口注入方式。
  还要注意上样前必须保证样品溶液和起始缓冲液在pH和离子强度方面保持完全一致,这可以通过缓冲液交换或者透析等方法来实现。但体积很大的样品显 然无法进行上述操作,此时可以通过对样品进行稀释,直至其与起始缓冲液离子 强度一致,然后再用酸碱调节样品溶液pH,使之与起始pH一致。这样,虽然 样品溶液在缓冲物质和盐的组成上与起始缓冲液并不相同,但由于pH和离子强 度方面的一致性,也能确保目的蛋白吸附在色谱柱上。 新发展起来的适用于规模化的是快速蛋白质液相色谱。FPLC在中等压力条件下工作,比传统色谱分离速度更快,分离效果更好。FPLC在实验室中被广泛接受,在中试和大规模蛋白质纯 化中也显示出了强大的潜力。相比于高压系统(如HPLC),它的一个优点就是 其设备用塑料而非不锈钢制成,可耐任何缓冲液,因而适于分离纯化蛋白质。