蛋白纯化方法选择

  蛋白纯化是生物学实验中非常重要的一步，许多实验建立在得到纯化蛋白之上，各种生物学样品，如细胞、组织、发酵液等，含有上千种的不同的蛋白，各种蛋白的含量不等，需要将目的蛋白从样品中分离纯化，选择合适的纯化方法是关键。下面我们就从不同的角度来分析：

一、根据蛋白的溶解度分离

  中性盐对蛋白的溶解度影响较大，在盐浓度较低时，蛋白的溶解度随盐浓度的升高而增加，当盐浓度达到一定浓度时，不同的蛋白溶解度会随着盐浓度的升高而降低并先后溶解出来，进而被分离。

  常见的方法是硫酸铵沉淀法，硫酸铵沉淀法纯化蛋白方法简便，但效果并不是很好，可以作为蛋白的初步纯化，常常结合其他纯化方法一起使用，达到多步纯化的作用。

二、根据蛋白分子大小分离

膜分离技术

  用于分离蛋白的膜具有多种规格的孔径，蛋白在一定的压力下，分量较小的蛋白能穿透膜的孔径，分子量较大的蛋白则被截留，不同分子量的蛋白则被分离。此方法适合分子量差异较大的蛋白的分离。

凝胶过滤层析

  该方法也称为分子筛，所使用的分离基质一般是葡萄糖凝胶，凝胶上有许多孔，形成筛子，当不同分子量的蛋白样品流经凝胶珠时，大分子蛋白无法进入凝胶孔而以较快的速度流程层析柱，小分子蛋白则能进入凝胶珠，以较长的路径和缓慢的速速流出层析柱，不同蛋白流出层析柱的速度不同。
凝胶过滤层析纯化蛋白是根据蛋白分子量大小分离纯化的最有效的方法之一。

三、根据蛋白带电性质分离

电泳法

  根据蛋白在同一pH环境中，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同得以分开，也就是现在使用较多分双向电泳。双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的结合，首先利用等电聚焦电泳将不同电荷的蛋白分开，再通过SDS-PAGE将不同分子量的蛋白分开。
  等电聚焦电泳利用两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就会停止，不同蛋白质被分离开。SDS-PAGE将同一等电点的蛋白根据分子量的大小进一步进行分离。

离子交换层析法

  离子交换层析法纯化蛋白的原理是蛋白质本身带有电荷，当经过离子交换柱时，被结合到与蛋白带有相反电荷的离子交换柱上，随后改变缓冲液pH或离子强度，被结合的蛋白被洗脱下来。由于不同蛋白所带电荷不同，与离子交换剂的结合能力也存在差异，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而将目的蛋白分离出来。

四、根据配体特异性的分离

亲和层析

  亲和层析是一种极为高效的纯化方法，能快速的将目的蛋白分离出来，而且纯度很高，因此使用最为广泛，特别是应用在蛋白表达与纯化上。
  该方法是利用蛋白与另一种称为配体的分子能特异性非共价地结合而设计，类似于抗原与抗体的结合，牢固又可逆。
  在重组蛋白表达中经常会将目的蛋白与标签多肽或标签蛋白融合表达，通过标签与配体之间的结合将目的蛋白分离出来，例如6*His标签多肽与镍柱的结合。

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