离子交换层析简介

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离子交换层析法是根据电荷特性分离生物分子的一种蛋白纯化方法,由于该法操作简易,分辨率高且通量大,迅速成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要方法。本文介绍了离子交换层析的原理,介质以及常见问题解析。

1.离子交换层析的基本原理:

  离子交换层析法是蛋白纯化的一种方式,通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换,从而达到分离纯化的目的。

离子交换层析原理

  离子交换层析法主要依据电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离,具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的,都可使其带电,所以离子交换层析法的应用很广泛。

2.离子交换层析的介质:

  有许多离子交换介质都已经商品化,但不存在一种神奇的介质其最适合各种蛋白质的纯化。选择离子交换介质的标准包括应用的特异性需要、样品成分的等电点和分子大小(即目的蛋白和污染物),以及可得到的装备(如泵和柱子)。

  首先需要选择阴离子或阳离子介质,如果目的蛋白的等电点已知,选择阴离子介质且操作的pH高于目的蛋白的pI,或选择阳离子介质且操作pH低于目的蛋白的pI。如果靶蛋白的pI未知,开始之前最好先测定它。最佳操作pH可根据经验确定。因为大多数蛋白质的pI低于7,选择阴离子交换和操作pH为8.5开始是合理的,然后根据估计结果和优化条件。知道蛋白质溶液中污染物pI和结合特征也是有用的。

3.离子交换层析的缓冲系统:

  必须根据需要的pH范围选择缓冲系统,必须考虑的因素包括所用的离子交换类型、样品的pH稳定性和使用的pH范围,以及需要的缓冲能力,最后是成本。下表列出了各种有用的缓冲液。缓冲液中的添加成分(如变性剂和蛋白酶抑制剂)也应和离子交换介质带有相同的电荷,以组织结合。

pK(25℃) pH范围 缓冲液 工作浓度/(mmol/L) 温度因子
阴离子交换
4.75 4.5~5.0 N-Methylpiperazine 20 -0.015
5.68 5.0~6.0 Piperazine 20 -0.015
5.96 5.5~6.0 L-Histidine 20
6.46 5.8~6.4 Bis-Tris 20 -0.017
6.80 6.4~7.3 Bis-Tris propane 20
7.76 7.3~7.7 Triethanolamine 20 -0.02
8.06 7.6~8.5 Tris•Cl 20 -0.028
8.52 8.0~8.5 N-Methyladiethanolamine 50 -0.028
8.88 8.4~8.8 Diethanolamine 20(pH8.4) -0.025
8.64 8.5~9.0 1,3-Diaminopropane 20 -0.031

pK(25℃) pH范围 缓冲液 工作浓度/(mmol/L) 温度因子
阳离子交换
2.00 1.5~2.5 Maleic acid 20
2.88 2.4~3.4 Malonic acid 20
3.13 2.6~3.6 Citric acid 20 -0.0024
3.81 3.6~4.3 Lactic acid 50
3.75 3.8~4.3 Formic acid 50 +0.0002
4.21 4.3~4.8 Butanedioic acid 50 -0.0018
4.76 4.8~5.2 Acetic acid 50 +0.0002
5.68 5.0~6.0 Malonic acid 50
7.20 6.7~7.6 Phosphate 50 -0.0028
7.55 7.6~8.2 HEPES 50 -0.0140

4.离子交换层析常见问题解析:

问题 可能的原因 解决方案
在盐梯度中蛋白质不能洗脱 缓冲液的pH不对
盐浓度太低
使用pH更靠近蛋白质pI的缓冲液
使用更浓的洗脱缓冲液
蛋白质出现在清洗相中 结合缓冲液的盐浓度太高
样品的盐浓度太高或pH错误
柱子没平衡好
离子变性剂或其他添加剂
结合到柱子上
降低结合缓冲液的盐浓度
更换样品的缓冲液
重复或延长平衡时间直到电导恒定
清洗柱子
分辨率比预想的要低 梯度斜率太抖
流速太高
蛋白质或脂质沉淀到柱子上
样品上样前没有恰当过滤
蛋白形成聚合体
凝胶紧密结合
柱子安装不好
检测仪的流动池或柱中或柱后的混合体积太大
使用更平缓的梯度或增加一个平台
较低的流速下分离
清洗和再生柱子
再生柱子、过滤样品、重复层析
使用脲素或变性剂清洗柱子
运行有色的化合物观察条带检测装柱效果,如有必要重装柱子
更换流动池或减小柱后体积
层析图中峰形前拖尾或太圆 柱子超载
柱子没装好
柱子需要再生
降低样品的上样量,重复试验
运行有色的化合物观察条带检测装柱效果,如有必要重装柱子
清洗再生柱子,如果这样还不行,换一个新的
层析图汇总峰形拖尾 样品太黏
柱子的滤器上或凝胶床的顶部
发生了蛋白沉淀
柱子装的不好
减低蛋白质的量,从样品中出去核酸
清洗柱子,更换或清洗滤器
获得的蛋白质量正常但活性低 靶蛋白在洗脱缓冲液中不稳定,因而失活了
酶与辅酶或对其活性是必需的因子分离
柱子上有微生物生长
变换洗脱条件
收集所有的组分进行测定并重复试验
清洗柱子并且在20%乙醇中或其他抑菌剂中保存凝胶
洗脱级分中蛋白质的量比预想的少得多 蛋白质被蛋白酶降解
在样品的准备中蛋白质吸附到过滤器上
柱子上有微生物生长
在缓冲液中加蛋白酶抑制剂
使用其他型号的滤器并在缓冲液中加变性剂
清洗柱子并且在20%乙醇中或其他抑菌剂中保存凝胶