His-tag蛋白亲和纯化原理方法及常见问题

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His-tag标签融合蛋白纯化的原理

  His-tag(组氨酸标签)是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸,在一般或变性条件(如8M尿素)下可以和Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上,这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上,因此带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上,而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱,从而得到较高纯度的 His 标签蛋白。用金属螯合亲合层析(IMAC)进行His标签蛋白纯化是目前原核蛋白表达纯化中最常用的方法。

His-tag标签融合蛋白的Ni柱亲和纯化

以下为钟鼎生物进行Ni柱纯化的sop:

(1)利用低压层析系统,上清溶液以0.5 mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose Cl-6B亲和层析柱。

(2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 mL/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线。

(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl,20 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0) 以1 mL/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线。

(4)用Ni-IDA ELution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0) 以1 mL/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液。

(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用20 mM Tris-HCl,0.15 M NaCl,pH8.0进行透析过夜。

(6)进行12% SDS-PAGE分析

缓冲液中为什么要添加咪唑?

  Ni柱中的氯化镍可以与有His-tag的融合蛋白结合,也可以与咪唑进行结合,当标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合时,不同浓度的咪唑通过层析柱,就会将与镍配位的标签蛋白、杂蛋白等分别洗脱下来,从而得到高纯度目标蛋白

(1)结合缓冲液中低浓度的咪唑是为了减少杂蛋白的非特异性吸附;

(2)洗涤缓冲液中低浓度咪唑是为了吸取吸附能力较弱的杂蛋白;

(3)洗脱液中高浓度咪唑是为了洗脱目的蛋白。

His标签蛋白不挂柱怎么办?

(2)若可以检测得His-tag,那么就有可能与蛋白质的结构有关,标签被“包埋”而暴露不出来 了,这样自然也是无法挂柱的。可以尝试一下把该标签构建于该蛋白质的另外一端,比如 原来是在N端的,改为在C端;同时也可以把该蛋白变性后再过柱,一般就是可以挂柱的。

(3)另外请确认一下层析buffer,别搞错了平衡液和洗脱液,同时再确认一下洗脱液的配方是否 正确,如果使用咪唑进行洗脱的,其浓度是否足够了,一般最高用到500mM。

His标签蛋白挂柱后洗脱不下来有什么办法?

蛋白挂柱洗不下来是因为洗脱条件太温和没有破坏蛋白挂柱的结合力造成的

(1)增加咪唑浓度或降低PH加大洗脱的强度。

(2)可能有其他非特异的吸附力,洗脱缓冲液加入去垢剂(0.2%的TritionX-100)。

(3)蛋白可能沉淀到柱子内部了,尝试降低上样量避免蛋白沉淀。

如果这些都尝试了依旧洗脱不下来就要从其他角度入手了

(1)加速试验的进程,尽量缩短接触时间

(2)用Co2+离子来替代Ni2+

(3)如果以上都不行,就只有重头构建载体了

纯化时用不同浓度的咪唑洗脱,可是每个都有目的条带,而且有杂带,是什么情况?

(1)镍柱出问题了,正常是蓝色,蓝色太淡最好重新挂镍,也有可能是目标蛋白和镍柱的结合力太弱了,建议用0.5EDTA把镍洗下来,换硫酸铜,用铜离子结合。

(2)柱子没平衡好,建议先用500mM的咪唑平衡,在用你的平衡液平衡。另外平衡液,上样液的缓冲液要一致,比如20mM Tris-HCL PH8.0,200mM 氯化钠,20mM的咪唑。加氯化的目的是减少离子结合,加咪唑的目的减少非特异性吸附,氯化钠浓度可在200-400mM之间。

(3)上样量太大,且清洗不到位,1ml镍柱的蛋白结合量也就30-40mg之间,可以根据这个估算上样量,上样量一般不超过蛋白结合量的50%,因为要给杂蛋白留出一些位点。上样完了,要用平衡缓冲液清洗,目的是把没结合的物质及过量的可结合的物质冲出柱子,这个一定要清洗干净,后续才能得到较好的纯度。

(4)所有缓冲液的PH要统一,而且不宜太低。

(5)尝试用其他纯化方式,比如离子交换层析

HIS标签蛋白纯化出来不纯怎么解决?

(1)柱子没平衡好。增加平衡的时间。

(2)洗脱拉咪唑梯度太大,可以拉梯度更细一些。

(3)非特异性吸附多,平衡缓冲液中加20mM的咪唑和400mM的氯化钠减少非特异性吸附。

(4)双标签纯化,在蛋白上同时添加His标签和Strepll标签,进行两步亲和层析