GST融合蛋白纯化操作指南

  ◎当前位置:首页>>技术服务>>重组蛋白表达服务>>蛋白纯化服务>>GST融合蛋白纯化操作指南

1.简述

  GST纯化系统是利用GST(glutathione-S-transferase)融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过二硫键共价亲和,通过GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。该纯化柱中,凝胶手臂上通过硫键结合一个谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽疏基转移酶(即GST-tag(26KD))之间酶和底物的特异性作用力,使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的手臂谷胱甘肽结合,从而将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。谷胱甘肽通常有氧化性GSSG和还原型GSH,当我们使用GSH洗脱时,GSH会与凝胶上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白,从而将目标蛋白洗脱。

2.实验试剂

表1 缓冲液及配方
GST纯化缓冲液 配方
Lysis Buffer 1×PBS;pH 7.4
Elution Buffer 1 1×PBS;50mM GSH;Ph 7.4

 

3.具体纯化步骤:

(1)收菌,每克菌加入10ml-15ml的非变性裂解液Lysis Buffer:1×PBS;pH7.4(非变性裂解液的选择:根据具体蛋白等电点PI值,选择合适的Buffer,在非变性裂解液中加入1%TritonX-100,2mM/ml PMSF, )重悬。(全程冰浴)

(2)超声破碎,把混合非变性裂解液的菌体在冰水中用超声探头破碎,超声3s,间隔6s.超声5-10Min。(超声完全的判断:溶液中有无块状物,溶液是否粘稠。)

(3)将破碎液用离心机离心12000r/min,4℃,30min,取上清,此条件可重复两遍,然后把上清和沉淀分别留样,坐上清纯化。

(4)取GST柱,清洗干净柱子,加入2-3ml GST柱(可根据具体GST的说明书选择合适的量),用非变性裂解液Lysis Buffer平衡柱子5-10倍柱体积。

(5)为了让柱子和上清充分结合,放置在旋转孵育器上孵育2-4h后取出纯化,整个孵育过程在4℃的层析柜中进行。

(6)孵育结束后,将孵育好的蛋白过柱,流出取样。

(7)用非变性裂解液Lysis Buffer洗去未吸附的样品,流速1-3ml/min,直到洗脱至流出液的紫外检测仪数值不在变化为止。

(8)用Elution Buffer 1洗涤蛋白至紫外检测仪数值趋于稳定,流速1-2ml/ml,收集样品,2ml/管收集。

(9)将收集的各浓度梯度洗脱下来的蛋白,取样,跑SDS-PAGE。

(10)根据SDS-PAGE电泳图,分析进行下一步实验。

4.GST柱的回收

(1)取待再生的GST柱,将其倒入空层析柱中。

(2)加入DDH2O冲洗柱子,冲洗5-10倍柱体积,流速1-2ml/ml。

(3)加入(50mM Tris,150mM NaCl,6M 盐酸胍,pH8.0)清洗柱子,冲洗5-10倍柱体积,流速1-2ml/ml。

(4)加入DDH2O冲洗柱子,冲洗5-10倍柱体积,流速1-2ml/ml。

(5)取少量柱子制样跑胶,若无条带,可进行下一步操作。

(6)将柱子储存在20%的乙醇中,放置在4℃层析柜中待用。