1.亲和层析技术的原理

  亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体-抗原，激素-受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。

2.亲和层析的常用标签

标签	纯化用的填料或配基	洗脱方法
多聚组氨酸（6✖His）	鳌合镍、铜、钴离子的填料	咪唑或降低pH
谷胱甘肽硫转酶（GST）	键合谷胱甘肽的亲和填料	10-20mM还原谷胱甘肽
麦芽糖结合蛋白（MBP）	淀粉琼脂糖凝胶	麦芽糖
金黄色葡萄球菌蛋白A	IgG琼脂糖凝胶	低pH
Flag peptide	抗Flag抗体,M1,M2	低pH或EDTA
多聚精氨酸（Poly-Arg）	SP琼脂糖凝胶	高盐
多聚半胱氨酸（Poly-Cys）	活化巯基琼脂糖凝胶	DTT
多聚苯丙氨酸（Poly-Phe）	苯基琼脂糖凝胶	乙二醇
钙调蛋白结合肽	钙调蛋白	EGTA
纤维素结合域	纤维素	盐酸胍或脲
几丁质结合域	几丁质	巯基乙醇，半胱氨酸

3.亲和层析的纯化介质及其作用原理

a. Ni柱纯化

  Ni柱中的镍可以与有6个组氨酸标签的碱性蛋白结合

  Ni-纯化介质是Ni离子金属螯合介质， Ni柱中的螯合的Ni可以与咪唑竞争性结合

  Ni亲和层析柱可分为——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni-IDA螯合了三价，Ni-NTA螯合了四价，所以IDA的载量要NTA比的高。IDA与蛋白结合能力较弱，载量相对较高，稳定性较差， Ni易脱落。而NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，特异性较高。

b.GST亲和层析介质（GST Agarose）

  是用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白，其谷胱甘肽转移酶与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。

c. 麦芽糖结合蛋白(MBP)

  有 42.5KD 大小，不含 Cys，作为融合蛋白的标签，通常放在 N 端在大肠杆菌中进行表达。MBP 能促进融合蛋白的可溶性表达，尤其对于难表达的真核细胞蛋白，膜蛋白病毒蛋白有很好的促溶表达能力，MBP 融合蛋白的纯化在生理条件下进行， 使用麦芽糖进行温和洗脱。保护了MBP 标签蛋白的活性。标签在纯化后期需要用酶切去除， 常用的内切酶是 Factor Xa，麦芽糖酶和肠激酶。

d. Protein A亲和层析介质

  常用于纯化和分离IgG。Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。天然Protein A有5个IgG结合域和许多其它的未知功能域。重组Protein A包含5个高IgG结合域，并去除了其它非主要结合域以降低非特异性结合。

  Protein A亲和层析介质已经广泛用于从生物流体或细胞培液中分离纯化各种类型的IgG或者IgG片段。实验已经证明，Protein A和IgG的相互作用仅涉及Fc区域，而不影响Fab片段和抗原的结合

e.FLAG-tag

  FLAG标签是由8个氨基酸（DYKDDDDK）组成的一个短肽，分子量很小，因而不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位与结构域，也不会改变融合蛋白的功能、分泌或运输。该标签具有天然的亲水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于利用抗体检测；同时含有一个肠激酶切割位点（DDDK），可以利用肠激酶切除标签。FLAG标签有2个特异性的单克隆抗体，分别为M1单抗、M2单抗。FLAG短肽合成成本较高，不适用于大规模纯化，且需要额外步骤除去结合在层析介质上的短肽。

f. Strep-tag Ⅱ

  用于蛋白在原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统等的表达与纯化中。通过对链霉亲和素特定氨基酸的定向突变，获得与Strep-tagⅡ具有更高亲和力的亲和介质Strep-tactin，在Strep-tagⅡ融合蛋白的亲和纯化中表现出良好的纯化效果，且蛋白质产量较高，所需成本适中。

  Strep-tagⅡ系统的纯化条件比较宽泛，在普通缓冲液下就可与strep-Tactin层析介质结合，使用2.5mmol/L的脱硫生物素就可将Strep-tagⅡ融合蛋白洗脱下来，螯合剂、去污剂、还原剂 及高达1mol/L的盐均可加入到缓冲液中。此外，Strep-tag Ⅱ在纯化过程中不依赖金属离子，十分适合含金属离子蛋白质的纯化。

4.常用于稳定蛋白的添加剂

类型	功能	常用试剂
还原剂	防止氧化	BME
		DTT
		Tris(2-carboxyethyl) phosphine(TCEP)
蛋白酶抑制剂	防止内源性蛋白酶分解蛋白	亮抑肽酶（丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂）
		抑胃肽（天冬氨酸蛋白酶抑制剂）
		PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）
金属鳌合剂	是金属蛋白酶失活	EDTA、EGTA
精氨酸激酶	稳定蛋白质结构，增强溶解性	丙三醇
		去污剂（如CHAPS、NP-40、Triton X-100）
		糖（如葡萄糖、蔗糖等）
离子稳定剂	增强溶解性	盐类如Nacl、kCI、（NH4））

5.亲和纯化蛋白的注意点

a. Ni柱进行蛋白纯化时注意点：

(1)避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，等等；
(2)各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；
(3)各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；
(4) 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；
(5)在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；
(6)缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）
(7)应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；
(8)缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
(9)可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）
(10)可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；

b. gst柱进行蛋白纯化时注意点

(1)在细胞裂解时，加入终浓度1–10 mM DTT可以显著提高GST融合蛋白的结合效率， 在Binding Buffer和Elution Buffer中加入1–10 mM DTT，可以提高蛋白纯度，但是会导致其产率降低
(2)超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性，导致蛋白不能与介质结合。
(3)在pH值低于6.5或高于8.0结合效率会降低，使用前需用pH6.5～8.0的Buffer如PBS进行平衡；
(4)增大Elution Buffer的pH值。Elution Buffer的pH值调至pH 8–9可以提高洗脱效率而不需要增加glutathione的浓度；
(5)增加Elution Buffer的离子强度。加入0.1–0.2 M NaCl能提高洗脱效率；
(6)Elution Buffer中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍GST融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside可以显著增加洗脱效率

c. proteinA柱进行蛋白纯化时注意点

(1)介质的选择A,G or 其他，其结合能力的选择
(2)上样流速尽量小，让Protein G和抗体有充分的结合时间
(3)在低pH值洗脱后，快速中和。
(4)长时间保存加入0.02-0.05％叠氮钠；
(5)加入10%甘油，可有效防止疏水作用引起的聚集。
(6)抗体纯度不够，杂蛋白含量高，易引起蛋白的沉淀。

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