无细胞表达案例

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摘要

本文介绍了无细胞表达蛋白的案例,通过PCR扩增启动无细胞表达,案例中包含了试验所需的试剂、反应体系以及实验简略流程,仅供参考。

一、试剂和耗材

1.1样品

1例质粒。

1.2主要试剂

试剂名称 试剂来源 Cat.No.
DNA Marker 2000 钟鼎生物 ZD02001
Protein N 康码芯(上海)智能科技有限公司 profac_std0110000
琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒 艾德莱 DR0102
2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix(With Dye) 高保真酶预混液 翊圣生物科技有限公司 10154ES
PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准 thermofisher 26619
其它试剂均为国产分析纯。

二、主要实验仪器

仪器名称 仪器来源 型号
LifeECO 基因扩增仪 BIOER TC-96/G/H(b)C
电泳仪 南京普阳 DYY-7C
电泳槽 北京君意 JY-SPCT
凝胶成像仪 Tanon 2500
台式高速离心机 湘仪 H1650-W
台式高速冷冻离心机 湘仪 TGL-16
移液器 Eppendorf 2.5 µl/100 µl/ 200µl/1000 µl

三、实验方法及结果

3.1采用PCR制备目的片段

引物: A:5'﹣GGT.....TAGG﹣3'
B:5'﹣GC....GTG﹣3'
C:5'﹣TAA......GATGCC﹣3'
D:5'﹣TTAT.....GGC﹣3'
E:5'﹣TTC.....TGGAG﹣3'
F:5'﹣CAT.....CGTCCT﹣3'

PCR反应体系如下:

PCR反应体系

PCR反应程序如下:

PCR反应程序
PCR反应程序

PCR反应程序如下:

Target ORF 制备反应程序
PCR电泳检测

图1 PCR电泳检测
Fig.1 PCR electrophoresis detection
Lane M:DNA Marker 2000
(从上到下:2000,1000,750,500,250,100)
Lane 1:PIF中间(回收)
Lane 2:阴性

目的基因制备PCR反应体系

PCR反应程序如下:

目的基因制备反应体系

PCR电泳检测

图2 PCR电泳检测
Fig.2PCR electrophoresis detection
Lane M:DNA Marker 2000
(从上到下:2000,1000,750,500,250,100)
Lane 1:目标片段
Lane 2:目标片段
Lane 3:目标片段
Lane 4:目标片段
Lane 5:目标片段
Lane 6:目标片段
Lane 7:目标片段
Lane 8:目标片段

电泳检测目的片段为1765bp 切胶回收。

3.2 采用ProteinFactory制造蛋白

1.把纯化好的目的基因加入ProteinFactory 28℃置于摇床110rpm孵育4-6小时。

2.3000xg 10min离心分离包涵体蛋白与上清蛋白。
将蛋白置于-80℃ 待用。

3.3 Western blot检测蛋白

western blot蛋白检测

图3 western blot蛋白检测
Fig.3western blo Protein detection
Lane M:PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
(从上到下:250,120,100,70,55,35,25,15,10)
Lane 1:无关蛋白
Lane 2:无关蛋白
Lane 3:PIF-2上清蛋白
Lane 4:PIF-1上清蛋白
Lane 5:PIF-2包涵体蛋白
Lane 6:PIF-1包涵体蛋白

四、结果分析

根据WB鉴定结果分析,蛋白分子量与理论分子量一致,蛋白存在断裂。已得到符合要求的蛋白。

 

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