WB实验过程
| WB实验所需试剂及器材 | |
|---|---|
| 器材 | |
| 转移电泳仪（上海天能，VE-180） | 转移电泳槽（上海天能，VE-180） |
| 气浴振荡器（南大普阳） | 暗盒（自配） |
| 台式微量高速离心机（H1650-W长沙湘仪离心机仪器有限公司） | 移液器（10µl/50µl/200µl/1000µl Eppendorf） |
| X光片（柯达） | |
| 试剂 | |
| ECL显色液：A B（普利莱） | 酶标二抗（HRP标记的羊抗鼠和羊抗兔） |
| 显影液，定影液（南京蓝格显影公司 ） | PVDF膜（Minipore(0.22um)） |
| 电泳液（Tirs 3g,甘氨酸14.4g,SDS 1g ,加水至1L） | 转膜液（Tirs 3g,甘氨酸14.4g,甲醇200ml,加水至1L） |
| 封闭液（PBS+5%脱脂奶粉，PBS+5%BSA） | PBST（PBS+0.05%吐温） |
| 10*PBS（35.8g磷酸氢二钠，2g磷酸二氢钠，85g氯化钠，加水至1L。） | |
操作规程：
1.制胶和制样
(1)制备相应浓度的PAGE胶;
(2)根据实验需求取适量抗原样品，加入2*或5*上样缓冲液，充分混匀后100度水浴10min，然后10000rpm 离心5min.
2.电泳
(1)按SDS-PAGE操作规程装好电泳装置，按实验设计上样，每个泳道最大上样量30ul，预染Marker上样3ul，需要根据蛋白大小确定使用哪种Marker.
(2)上样完毕后，接通电源，按胶的不同选取不同的起始电压。自制聚丙烯酰胺凝胶先100V跑完积层胶，再将电压升至120V直到电泳结束。
3.转膜
(1)电泳结束后，将凝胶放置转膜液里浸泡5-10min，PVDF膜在甲醇中浸泡15s,膜成半透明状，在超纯水中冲洗一下，放入转膜液中转膜浸泡后转膜。转膜顺序为：负极-海绵垫-三层滤纸-胶-膜-三层滤纸-海绵垫-正极。如同时操作多张膜需在膜上编号以便区分。
(2)恒流280mA，根据分子量大小确定转膜时间。分子量>80KD转膜时间1.5-2小时，分子量＜80KD转膜时间1小时，分子量＜20KD转膜时间45min，恒流200mA.
4.封闭
电转结束后，取出膜用PBST洗涤4次，每次5min。然后置于37度摇床封闭1小时。视情况而定采用封闭液。
5.一抗孵育
PBST稀释一抗（稀释倍数视情况而定），稀释体积一般3-4ml放于抗体孵育盒中4度过夜，内参可以37度1小时。
6.洗膜
一抗结束后，用PBST洗涤4次，可以37度也可以25度，每次5min（磷酸化抗体可以洗三次，每次5min）。
7.二抗孵育
用5%的牛奶封闭的稀释二抗（1:10000）.膜在二抗中37度1小时。3.8洗膜4次同上。
8.洗膜4次同上
9.显影
ECL法：
(1)用平板纸吸去膜上的水分，将膜放置于平面上，取等体积的ECL液A和B液混匀后加入膜上反应1min
(2)然后取膜弃去ECL发光液于暗盒中显影，可根据背景及条带的强弱选择不同的曝光时间。
(3)记录好显影时间及配置时间，一般显影液可使用1-2周，定影液2-3周，像信号较弱的，可通过更换显影液加强显影的强度。
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