毕赤酵母宿主菌株选择

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目前常用毕赤酵母宿主菌株的类型:

  目前, 已有大量不同基因型的毕赤酵母可用做表达宿主, 常用于外源基因表达的毕赤酵母菌株有SMD1168 (H) 、SMD1165、SMD1163、GS115、X-33、MP-36、MC100-3、KM71 (H) 等, 菌株的选择应根据具体需求而定。根据利用甲醇的能力, 酵母菌株可分为3种表型:

  (1) 甲醇快利用型 (Mut+) , 包括X-33、SMD1168与GS115等大部分菌株, 此类菌株同时含有编码醇氧化酶AOX1和AOX2。基因有研究发现, 在异源表达木质素过氧化物酶H2时利用X-33菌株的表达量明显高于使用SMD1168菌株, 这可能是由于SMD1168菌株中pep4基因对异源表达木质素过氧化物酶H2有负面影响;

  (2) 甲醇慢利用型 (Muts) , 如KM71菌株, 其中只含AOX2基因, 只能依赖AOX2产生AOX;

  (3) 甲醇不利用型 (Mut2) , 如MC100-3, 其AOX1及AOX2基因均被敲除。

表达宿主菌的选择原则及改造:

  从研究结果来看, 蛋白胞内表达时, 可优先考虑用Muts表型, 对于分泌表达, Mut+ 和 Muts都可使用。SMD1168、GS115、KM-71等大部分酵母菌株也是组氨酸脱氢酶缺陷型 (his4),可据此利用不含组氨酸的培养基筛选重组子。而SMD1163、SMD1165和SMD1168等为蛋白酶缺陷型, 因此可有效降低外源目的蛋白的酶解。在菌株遗传改造方面, 人工失活毕赤酵母的某些蛋白酶基因, 获得稳定的突变体也可有效减少外源蛋白的降解, 如毕赤酵母YPS1基因的失活可明显减少人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白的降解。最近报道, 非标记遗传修饰对菌株改造具有重要意义, 这种方法是在载体AOX1后引入mazF基因, 形成mazF-ZeoR表达框, 同时两侧包含CYC1 TT同向重复重组位点和多克隆位点, 这样可以Zeocin抗性为正筛选标记, 以mazF基因为反筛选标记。菌株遗传修饰时, 首先通过Zeocin筛选出基因改造的菌株, 再进行甲醇诱导表达mazF, 实现遗传标记的再利用, 这样既可以完成菌株的遗传改造, 又不会引入非必要遗传标记。使用此方法, 研究者成功进行了毕赤酵母ARG1和MET2基因敲除和绿色荧光蛋白基因的敲入及ARG1基因的定点突变, 最终均未引起非必要遗传标记的保留。