膜蛋白纯化方法介绍

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    膜蛋白与磷脂双分子层的缔合模式决定了所采用的纯化方法。如果蛋白嵌入在疏水相中,将内在膜蛋白以可溶形式释放则需要破坏磷脂双分子层或者裂解膜定位多肽链,而且所有后续的纯化操作中,都会要求膜内疏水界面与水介质之间屏蔽,通常可利用去污剂来实现。而对于外周膜蛋白,可以通过改变缓冲液离子强度或者在更宽松的条件下引起一定程度的变性,将蛋白从膜上分离。

膜蛋白

    由于膜蛋白一般只占细胞总蛋白的很小一部分,任何污染都会产生很大的影响,因此,最有效的初始步骤就是得到尽可能纯的适当的膜制剂。一般从全细胞或组织开始。有些细胞 (如红细胞和肿瘤细胞)通常不经过普通的胞溶作用,就可以得到原生质膜或含有分散的小蛋白集合的典型微泡。脊椎动物和无脊椎动物的视网膜也是较好的材料,膜上含有主要的光反应结构,通过温和搅拌,几乎可以完整无缺地从细胞上释放出来。膜片段或亚细胞器的分离可通过不同的方法实现,一般使用离心技术,其他的方法包括多聚物双相分离、高压自由流动电泳以及 (免疫)亲和色谱和凝胶过滤色谱。

    蛋白质一般可以根据分子大小、电荷性或疏水性及专一性进行分离。对于内在膜蛋白虽然同样适用,但其疏水特性和溶解所要求的特殊条件经常成为关键的限制因素,而对于外周膜蛋白,采用水溶性多肽的处理方法比较合适。本文主要介绍内在膜蛋白纯化的方法。

蛋白表达与纯化实验室

1.根据分子量的分离

(1)酸化有机溶剂 大部分糖基 “软性”树脂 (Sepharose,Sephadex,Superose)并不适用于纯的或酸化的有机溶剂,此时,其溶胀效果并不满意,分离能力也大大降低,而且可能会严重吸附蛋白。相反,合成的聚合树脂 (如羟化聚醚)和羟丙醇葡聚糖 (Sephadex LH20和LH60)在该条件下却可用于常规HPLC或者FPLC系统。此外,硅胶载体在有机混合物中作用充分,但在酸性溶液中缓慢降解。聚丙烯酰胺在酸性水溶液中表现良好 (即使甲酸达到70%),但在非水相条件下效果不太满意。接触有机溶剂的所有器件都应由玻璃或聚四氟乙烯制成。在酸化条件下,蛋白质会有部分甚至完全变性。采用强酸条件时,尽可能保持较短的操作时间和较低的温度,并在使用后以较温和的溶剂清洗树脂。

(2)去污剂和变性剂 使用水溶性去污剂的凝胶过滤经常是一种非常有效的初步分离步骤。实际上所有树脂都可成功应用各种去污剂和变性剂 (尿素、盐酸胍),但需要注意以下几点:
① 柱缓冲液应含有接近或高于其 CMC的去污剂,有助于在色谱过程中确保蛋白质不会聚集,沉淀或丧失活性;
② 去污剂与蛋白质的结合会产生比蛋白质本身分子量更大的分子,高孔隙率树脂 (如Sepharose)易实现有效分离;
③ 膜中的脂质与去污剂会形成混合胶束;
④ 少数情况下,蛋白质可能与树脂不可逆吸附,特别是葡聚糖基载体,改用惰性较强的材料如聚丙烯酰胺可以弥补这一点。

2.根据电荷分离

(1)电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳和电荷转换电泳可以应用于内在膜蛋白分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳在处理内在膜蛋白时,电泳可在非变性去污剂如 TritonX-100或脱氧胆酸中进行,但有时溶解情况不好,还会出现聚合和 “拖尾”现象。电荷转换电泳利用了内在膜蛋白在其暴露的疏水区域与去污剂结合的特性。由于使用的非变性去污剂可能为中性,或带有电荷,结合到蛋白质上就可能改变其带电状态,因而改变电泳迁移率。因此,不同的去污剂可以引起不同的电泳行为,可以作为一种天然蛋白是否含有重要的暴露疏水区域 (因而是否属于内在膜蛋白类)的指示剂。对于回收少量非常纯的蛋白,特别是在应用电洗脱时,等电聚焦是一种很有效的实用工具。膜蛋白具有很宽的等电点范围,假如能得到非聚合状态的蛋白,去污剂中的等电聚焦是非常成功的,因此同一蛋白的不同磷酸化形式也可被分离。内在膜蛋白的处理方法与一般水溶性蛋白处理方法略有不同,只是包含了去污剂,通常是非离子型去污剂 (两性离子去污剂也可采用),以防止其掩盖蛋白质的原有电荷。

(2)离子交换色谱 常用于蛋白质纯化的所有离子交换系统也可用于纯化内在膜蛋白。该方法与等电聚焦一样,也需要去污剂,而且去污剂的选择受到保持蛋白质天然结构和带电特性要求的影响。非离子型去污剂通常比较适合,而两性离子类也可采用。非离子型的 CHAP系列去污剂,DEAE-类载体和 CM-类载体以及羟基磷灰石已经成功用于膜蛋白分离。

(3)色谱聚焦 该技术所用的载体在pH=3~12范围内抗降解,最有效的范围是pH=5~9,它可与中性有机溶剂,变性剂如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍以及中性或两性离子去污剂一起使用。如果蛋白质保持溶解而且不聚合,该方法快速而有效。去污剂如毛地黄皂苷和单月桂酸钠在高于其 CMC浓度条件下使用处理视紫红质时,该方法很有效。

    对于固相蛋白测序仪,蛋白质可以从凝胶上直接电泳转移到衍生化玻璃纤维纸或聚二氟乙二烯 (PVDF)上。未预先活化的 PVDF膜可用于气相仪。转移后的蛋白质经考马斯亮蓝或荧光染料显影,将显色斑或显色条带切下后可直接放入测序仪中。

3.亲和色谱

    在膜蛋白领域,亲和色谱已成为一项特别有价值的技术。由于许多膜蛋白都是糖基化蛋白,与碳水化合物结合的凝集素是很有效的。它们很容易与多种载体结合,而且在非变性去污剂中十分稳定。由于其具有不同的糖特异性,因而可用于区分糖蛋白。含有糖基的去污剂应进行检验以确保不会与所用凝集素的活性位点相结合。当目的糖蛋白含有一个末端唾液酸残基时,大部分其他膜糖蛋白可利用不同特异性凝集素组合 (例如Lensculinaris植物血球凝集素和小麦胚凝集素)从混合物中除去。未结合的含唾液酸部分可用唾液酸苷酶处理除去这一残基,从而产生一个新的末端糖基而被凝集素亲和载体所识别。