哺乳动物细胞培养蛋白质的纯化

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    本文介绍了哺乳动物细胞培养蛋白质的纯化,包括高品质蛋白纯化的注意事项、哺乳动物细胞的分离、产品的初步回收和分离以及主要纯化方法。

哺乳动物细胞蛋白纯化工艺发酵

注意事项

    一般动物细胞生产的重组蛋白主要性质可归纳如下:以天然的正确折叠形式 分泌到培养基中;正确进行翻译后修饰;重组蛋白分子量没有限制;哺乳动物细 胞不产内毒素;产物浓度低;培养基中的蛋白含量可能较高;生产流程可能含有 病毒、DNA或细胞蛋白,必须通过下游工艺去除。

    哺乳动物细胞来源的蛋白纯化策略不仅要能够可重复生产,满足一定纯度要求和特定形式,而且应消除可能来源于制备过程中的潜在有害污染物,包括细胞或培养物中的动物蛋白、病毒以及DNA,或者用于细胞培养的抗生素等。 以下事项需要注意:

① 卫生要求,所有分离步骤必须能在平静的条件下操作,而且不应引入生物负荷或内毒素,纯化原料应是无菌的,而且内毒素含量很低,不使用抗生素。
② 不能蒸汽灭菌的工艺材料 (如色谱载体)必须采用其他有效方式清洗和脱热原。典型的方法包括用消毒溶液如0.2~0.5mol/L NaOH或酸性乙醇(60%乙醇/0.5 mol/L 醋酸)处理,氢氧化钠/乙醇混合物(如50% 乙醇/ 0.2mol/L NaOH)也可采用,处理时间一般为室温下4~24h。
③ 工艺的完整性,确保产物能够从一个操作步骤直接进入到下一个步骤,中间不需要额外的操作,是比较理想的。
④ 无论是对于机械力还是不利的培养条件,哺乳动物细胞比微生物细胞要脆弱得多,所以必须注意保持细胞的完整。需要细心控制培养和细胞分离条件,避免由于细胞溶解而释放的胞内蛋白对产物的污染。

    适用于哺乳动物细胞培养或转基因动物生产的重组蛋白或单克隆抗体的典型 纯化方案一般包括初步分离 (过滤或离心、超滤浓缩)、离子交换 (或亲和)色谱、凝胶过滤等,最终得到纯度99%~100%的产品。

细胞分离

    哺乳动物细胞非常容易被机械剪切力所损伤,需要采用温和的分离方法。实际上哺乳动物细胞很容易沉淀 (甚至可以利用原始的重力沉降),可以在(1000~1500)g下有效地离心分离而无损伤。近来开发的专用于动物细胞分离的完全封闭的离心分离机,具有低离心力、低剪切蠕动泵、无旋转密封的特点。

    近来,一些色谱基质已经被开发应用,使得可以从细胞培养物中直接有效地捕获目的产物而不需要预先进行细胞分离。需要注意的是,产物的最优结合条件不一定与细胞存活所要求的最优条件相一致,这可能导致细胞的溶解和细胞内容物的释放,从而增加下游处理的负荷。

产品的初步回收和分离

    由于只有很少量细胞溶解,哺乳动物细胞培养上清液所含核酸很少,一般不需要利用核酸酶处理以降低原料黏度。

20L哺乳动物细胞蛋白纯化发酵罐

    澄清后的培养液中目的蛋白浓度相对较低,含有高浓度的来自培养基的小分子物质,初步分离纯化可减少主要的污染物。具体方法包括蛋白质沉淀 (盐或有机溶剂),目的蛋白的吸附和液液萃取等。超滤法现在已被广泛使用,因为超滤易于操作,不会使蛋白质处于极端或变性条件,易于放大规模,不会引入潜在的污染物。但超滤没有很好的分离能力,因为可透过膜的颗粒大小范围很宽,而且也会浓缩可能存在的病毒颗粒。超滤的另一个问题是由于微粒或者某些蛋白在膜 上形成胶层,可能会产生膜阻塞的问题,用于哺乳动物细胞培养的某些防沫剂也可能堵塞超滤膜。将样品适当澄清能够对此问题的解决有所帮助。

    乳汁是一种复杂的胶状悬浮物,含有高浓度的酪蛋白胶粒和其他乳汁蛋白、脂肪液滴、宿主细胞以及宿主细胞溶解产生的蛋白和核酸。乳汁中重组蛋白质产品的初步回收和分离采用乳品加工业所建立的技术,包括:撇沫和离心除去脂肪,酸法或盐法沉淀酪蛋白,过滤去除颗粒。这些步骤增加了从乳品中制备纯蛋白的成本,比通常从细胞培养上清液中得到的最终产品百分收率还要低很多。含有目的蛋白的澄清乳清部分可作为浓缩原料,用于后续纯化步骤。

主要纯化方法

    哺乳动物细胞生产蛋白质主要是用于生物医药。对于这些高附加值产品纯化 步骤的主要任务是制备安全、纯净、可重复的蛋白。为得到较高的产率,增加处理强度以及优化过程的经济性,以尽可能少的处理步骤实现这一目的非常重要。这就需要选择对动物细胞产物具有最高解析能力,可提供必要的蛋白纯度,特别是对可能存在的病毒和 DNA污染物具有满意去除率的一系列互补的特异性单元操作。商业上大部分实际处理方法可经3~5步纯化达到这一要求,还有许多其 他技术也可达到这一要求。实际上,柱色谱法是涉及哺乳动物细胞产物纯化最常考虑的方法,比如离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱等。利用两种不同类型色谱分离柱,将其串联使用,由于操作条件要求不同,有时也许更具优势,比如经离子交换柱得到的高离子强度洗脱液,也许可直接适用于疏水作用色谱,反之亦然。亲和色谱是高选择性的蛋白质纯化方法,在某些情况下可以获得绝对专一的产物,例如固定化单克隆抗体可通过 “免疫亲和”纯化相应抗原,固定化激素可纯化其受体等。但固定化抗体本身据认为具有被病毒或其他物质污染的可能,因此所用抗体本身应是医药级的。在抗体纯化领域,蛋白 A(来源链球菌 Streptococcusaureuse)已广泛应用并获得成功。该蛋白对大部分免疫球蛋白亚型的 Fc区具有高亲和力,可专一性结合。主要来自于植物的凝集素可选择性结合糖蛋白中的不同糖部分,虽然对于特定蛋白并不是绝对专一,但凝集素亲和色 谱可在一步内完成非常有效的纯化。凝集素通常是有毒性的,比如强效的血球凝集素或促分裂素,这一点应引起注意。

    近来,染料亲和分离方法得到了快速发展,该方法蛋白质结合容量非常高,合适的染料既便宜又易于大量获得,与非毒性试剂配合使用简单,利用适当的基质,配基渗漏可尽量降低,可得到较高的解析率。新型染料亲和柱可经受包括氢 氧化钠等消毒溶液的处理而不渗漏。

    当蛋白质已经达到必要的纯度和浓缩形式后,最后步骤通常是精制,一般采用凝胶过滤色谱,对于从可能已经形成的凝聚体中分离蛋白质,去除残留的添加剂等都特别有效。哺乳动物细胞生产生物医药产品时,去除内源或同源蛋白质的可能来源是一个问题,包括细胞培养中的宿主细胞和用于培养基的动物蛋白,或者转基因动物的宿主细胞和血清蛋白。仔细适当的分离条件对于除去污染物是很有帮助的。动物来源的痕量蛋白,包括同源蛋白的检测经常通过灵敏的免疫学测试而完成。