包涵体蛋白纯化与复性

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什么是包涵体蛋白?

  包涵体是在重组蛋白表达过程中,在细胞(菌体)内通过诱导新合成的肽链错误折叠,而发生聚集产生的不溶于水、无生物活性的聚集体。特别是在大肠杆菌表达真核细胞蛋白时最为常见。包涵体蛋白无生物活性,为此常常让需要制备活性蛋白来开展下游实验的科研工作者们头痛不已。

包涵体形成的原因

  主要因为在蛋白表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。

包涵体形成原因
表达量过高 折叠时间不够
二硫键非正确配对
蛋白间存在非特异性结合
蛋白溶解度太低
氨基酸组成 含硫氨基酸(半胱氨酸,胱氨酸)
脯氨酸(D型,亚氨酸,在蛋白结构折叠时往往需要异构酶辅助)
蛋白所处环境 发酵温度高
胞内pH接近蛋白的等电点
异源蛋白 缺乏真核生物中翻译后修饰所需要的酶类

包涵体蛋白的洗涤

  包涵体蛋白的洗涤主要是洗去包涵体上的杂质,如外膜蛋白,质粒DNA等,方法上网上大同小异,但是注意一点,做包涵体的洗涤需要先做一个洗涤液的尿素浓度梯度,这样才能达到最佳的洗涤效果。如果洗涤效果好的话,合适的洗涤液洗涤3次后,目的蛋白的纯度可以达到90%左右,洗涤的效果通过page就可以看出来了,如果将洗涤液的浓度做一个合适的梯度,分别洗涤包涵体之后在一个板子上跑page,效果非常明显的。

包涵体蛋白的溶解

  溶解这一步常常会出现溶解不完全等问题,首先要确定超声的质量很好,不然的话尿素没办法接触到包涵体也就达不到溶解的目的了。
其次,最好别在室温放置太长时间,如果有可能的话可以在包涵体洗涤液1,2都洗涤之后加入8M的尿素,然后再在每个EP管中加入15ul的DTT后4度冰箱过夜。 可以超声后低速离心如(4000/5min)去除细胞沉渣,因为低速离心不足以使包涵体沉淀,而细胞残渣和杂质却可以离的下来。
这样,过夜后,看看EP管内是否还有沉淀,如果没有的话就说明包涵体完全溶解了。

包涵体的复性

  复性遵循的三原则:低浓度、平缓梯度、低温

  复性是一个非常复杂的过程,除与蛋白质复性的过程控制相关外,还很大程度上与蛋白质本身的性质有关,以下这些包涵体蛋白复性注意事项前人总结的很好:

1.最适pH值范围为8.0-9.0之间;(这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成)
2.最适温度4℃;
3.低分子化合物 如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度;脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂,都可阻止蛋白聚集;Tris对蛋白质复性有促进作用;EDTA可以防止蛋白降解;
4.首先要获得较高纯度的包涵体;洗涤需彻底,加入适量Triton-X100
5.包涵体溶解要彻底,一般应使溶解液体量较大,不要怕蛋白被稀释,要有助溶措施;
6.透析前后均要离心;
7.复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h ;
8.复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定
9.复性时的蛋白浓度不宜太高,一般为0.1-0.5mg/ml,太高的浓度容易形成聚体沉淀,太低的浓度不经济,而且很多蛋白在低浓度时不稳定,很容易变性。

复性方法比较

复性方法 条件 优点 缺点 文献报道 质量回收率 活性回收率
稀释 低蛋白浓度 简单 易沉淀;速度不易控制;体积大 4倍体积稀释 约50% 80%
透析 低蛋白浓度;多次透析 控制折叠,缓慢进行 易沉淀;不适合大规模操作;周期长 50倍体积透析液 / 约70%
凝胶过滤层析 低蛋白浓度 柱上不保留;部分纯化 柱顶端易聚集 Superdex 75 约70% 84%
离子交换层析 无盐酸胍;低盐浓度 利于二硫键形成;部分纯化 多点吸附,限制折叠 SP Sepharose High Performance 97% 88%
亲和层析 含特殊结构,无强还原剂 特异性强;部分纯化;固定化分子可重复使用 成本高;配基易失活 固定化GroEL、DsbA/DsbC 100% /
亲和层析 含特殊结构,无强还原剂 特异性强;部分纯化;固定化分子可重复使用 成本高;配基易失活 固定化GroEL、DsbA/DsbC 100% /
疏水相互作用层析 高盐浓度吸附 抑制聚集;部分纯化 需优化 Poros PE 85% 86.3%

复性过程中使用的添加剂

  蛋白质的折叠是一级反应,而相互聚集是二级以上反应,由此可见低蛋白浓度有利于获得较高的复性效率。但是低蛋白浓度必然要求巨型反应容器,使得复性过程耗资严重,步骤繁琐,这显然阻碍了其用于大规模的工业生产。目前来说,最实际的做法是在复性过程上加上添加剂,希望实现高浓度下的蛋白质复性。

小分子添加剂:如最早用的变性剂是脲素和盐酸胍,主要通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白分子间的各种化学键,低浓度增加蛋白结构柔韧性,干扰聚集,增加复性的效率。还有一些还原剂如DTT,可以游离巯基提供还原性环境,EDTA鳌合金属离子,防止氧化。再比如一些脂类的脂质体,可以结合蛋白疏水区,表面电荷和膜流动性,促进折叠等等等等。

表面活性剂:如前面提到的去污剂Triton-X100,能够与包涵体蛋白结合成复合物,降低分子间疏水作用。

分子伴侣:这样的添加剂有DsbA、PDI,能够催化二硫键的形成与重排,还有大家熟悉的PPI,可以催化脯氨酸肽键的顺反异构反应。

复性结果的检测

根据具体的蛋白性质和需要,可以从生化、免疫、物理性质等方面对包涵体蛋白的复性效率进行检测。

双向凝胶电泳:检测结构均一性和二硫键的定位,第一向基于等电点不同,第二向按分子量不同,拖曳图像指示巯基化、二硫键的形成。

光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等,利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测,但一般只用于复性研究中的过程检测。

色谱方法:如IEX、RP-HPLC、CE等,由于两种状态的蛋白色谱行为不同, 生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定,较好的反映了复性蛋白的活性,值得注意的是,不同的测活方法测得的结果不同,而且常常不能完全反映体内活性。

黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加,变性状态时由于疏水残基暴露,一般水溶性很差,大多形成可见的沉淀析出。

免疫学分析:如ELISAWestern Blot等,对蛋白的特异性进行鉴别,重组蛋白作为抗原,复性结构的差异会导致其抗体的结合亲和力的改变,能够较为准确的反映包涵体蛋白的折叠状态。