包涵体纯化蛋白复性案例分析

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案例背景

使用IPTG诱导表达目的蛋白a。优化表达条件,将诱导条件调整至37℃,经分析目标蛋白主要呈包涵体形式。因此通过变复性的方式,重溶目标蛋白a,通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。

蛋白表达鉴定结果分析

IPTG诱导蛋白表达,经12% SDS-PAGE分析,目标蛋白主要存在于沉淀中,结果如图所示

包涵体蛋白

图1 蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析
Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression
M: 蛋白质分子质量标准
1: 未诱导
2: 诱导后
3: 诱导破碎后上清
4: 诱导破碎后沉淀

包涵体蛋白的变复性

1. 将菌体沉淀重悬于20 ml 裂解液 (20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail, pH 8.0),超声破碎(功率400 W,工作4sec,间歇8sec,共20min);

2. 将超声破碎的细胞裂解液4℃ 10000 g离心20 min,收集沉淀;

3. 使用包涵体洗涤液(20mM Tris,1mM EDTA,2M尿素,1M NaCl,1%Triton X-100,pH8.0)洗涤包涵体3次;

4. 用溶解缓冲液(20mM Tris,5mM DTT,8M尿素 pH8.0),按一定比例溶解包涵体,4℃放置过夜;室温,15000 rpm离心15min;

5. 将上述溶液滴加20 mM Tris-HCl ,100 mM NaCl ,pH8.0缓冲液中,逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌,将蛋白溶液装入透析袋于20 mM Tris-HCl,100 mM NaCl,pH8.0溶液中透析过夜。

包涵体融合蛋白的Ni柱亲和纯化及结果分析

包涵体蛋白Ni柱纯化

1. 利用低压层析系统,包涵体溶液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱;

2. 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;

3. 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl,20 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0) 以1 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;

4. 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0) 以1 ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;

5.上述收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用20 mM Tris-HCl,0.15 M NaCl,pH8.0进行透析过夜;

6. 进行12% SDS-PAGE分析, 结果如Fig.2所示。

纯化结果分析

包涵体经过变复性的方式,重溶目标蛋白,通过Ni柱亲和纯化获得目标蛋白,进行12% SDS-PAGE分析。

包涵体蛋白

图2 蛋白纯化SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of fusion protein purification
M: 蛋白质分子质量标准
1: 破碎后处理样品
2: 流出
3: 洗脱

Western Blot方法检测包涵体复性

(1) 取样品上样5 μl

(2)上样完毕后,聚丙烯酰胺凝胶先90 V跑完积层胶,再将电压升至200 V直到电泳结束。

(3)电泳结束后,取下凝胶进行转膜,恒压100 V转膜,约为1.5h,恒流250 mA

(4)电转结束后,取下膜后先用PBST洗涤4次,每次5min。

(5)将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1h。

(6)用封闭液稀释一抗,膜在一抗稀释液中4℃过夜。

(7)次日将膜取出后用PBST 洗膜4次,每次5 min,

(8)用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。

(9)反应完毕后,把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次,每次5 min。

(10) ECL显影,曝光。

Western Blot结果分析

一抗以及二抗稀释比例:

编号 抗体名称 稀释比例 二抗名称 稀释比例
1 His 1:1000 羊抗兔 1:5000

包涵体蛋白

图3 蛋白Western Blot鉴定分析
Fig.3 Western Blot analysis of fusion protein purification
M: 蛋白质分子质量标准
1: 纯化后样品