内毒素去除的方法总结及去内毒素注意事项

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  内毒素的去除是做蛋白表达质粒提取时至关重要的一步,同时也是非常棘手的问题,本文就针对内毒素的去除方法以及各方法的注意事项进行了归纳总结。

什么是内毒素?

  内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来,所以叫做内毒素。

内毒素

  所有能引起热原反应的物质称为热原。药品中的热原主要是细菌内毒素。一般可以认为:细菌内毒素是热原,但热原不等于细菌内毒素。

细菌内毒素的理化性质

• 耐热性:彻底灭活需250高温干烤一小时
• 水溶性:可溶于水,生产中可用无热原水冲洗以除去热原。
• 不挥发性
• 被吸附性:可被活性碳吸附
• 被酸碱破坏: 0.1M HCl或0.1M NaOH 浸泡4小时
• 被氧化剂破坏:30%双氧水浸泡4小时,可完全破坏

内毒素的去除方法

器皿中内毒素的去除:

a.干热法

适用对象:耐热物品如玻璃制品、金属制品等生产过程中所用的容器
处理方法: 180℃3~ 4h 或 250℃ 30min~ 2h
注意事项
• 1.在干烤前,被加热的玻璃器皿上最好不要有水珠,否则可能会使玻璃器皿损坏。
• 2.烘烤结束后,玻璃器皿不要马上从电热烘箱中拿出,要等温度适度降低之后才可以拿出,以免因温差太大而造成玻璃器皿损坏。
• 3.器皿上不能含有纸质或塑料制品,以免烘烤时燃烧或熔化。

b.化学降解法

适用对象:主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的内毒素。

处理方法:常用3~5%双氧水、重铬酸钾硫酸清洁液(重铬酸钾∶硫酸∶水常用配比1∶1∶10 或1∶2∶8 )、0.1M HCl或0.1 M NaOH浸泡去除。一般处理4h以上。

注意事项:佩戴防护用具,防止皮肤直接接触。

溶液中内毒素的去除

方法 原理 优点 缺点
液相分离法 一些去污剂,如Triton X-114,脱氧胆酸钠能够和内毒素的脂质部分结合,通过液相分离的方法萃取内毒素从而使后者有效地去除。 对内毒素的去除率高,且不影响有效成份的活性。该法简单高效、价格低廉、适合大规模应用,在我们日常的蛋白纯化中较为常用。 去内毒素后的样品会有微量去污剂的残留。
分子筛法 分子筛是利用凝胶的网状结构,根据分子大小进行分离的一种方法。由于蛋白质和内毒素的分子量有较大差别,因此利用分子筛可以有效去除内毒素。 去除效果明显 每次处理量小,处理时间较长。
离子交换色谱法 当溶液pH>2时,内毒素带有负电荷。因此内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。柱上的内毒素可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。 成本低,吸附容量大 但不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况。
亲和色谱法 将适当的配基固载于色谱基质上合成出亲和介质,使它特异性结合内毒素。GenScript将多粘菌素B(PMB)偶联于Sepharose FF 上,以此介质特异性吸附内毒素。 高效能、高选择性 相对成本较高。
超滤法 由于内毒素具有较大的相对分子质量,因此可选用超滤膜去除溶液中的内毒素。 操作简单,处理量大 操作过程中的压力较高。 不适合含有较大相对分子质量成份的样品。因为在除去热原的同时会阻留或吸附样品中的有效成份,使产品收率大受影响。
吸附法 活性炭用于去除内毒素是由于内毒素的相对分子质量较大。适合于组分较为简单的小分子的溶液中或水中去除内毒素。活性炭常用量为0.1%~0.5%。 成本低,处理量大。 活性炭的选择性较差,易吸附有效成份,纯化后溶液中的残余活性炭不易去除,且自身可能含有的重金属造成样品污染,因此目前很少使用
蒸馏法 此方法可用于生产去热源水,作为注射用水或洗涤水 去除效果明显 成本较高
疏水层析法 内毒素的脂肪A 部份有很强的疏水性, 但在高盐下会凝集, 无法挂上疏水层析柱。因此可选择能结合目标蛋白的疏水介质去除内毒素 适用于高盐浓度的样品 目前技术不够成熟,还需要进一步探索

但是,各种去内毒素的方法不是孤立的,可以相互结合使用。 比如,如果液相分离法得到的蛋白内毒素水平未达标,可以接着利用分子筛法进一步去除内毒素。

作为目前去内毒素常用的方法,液相分离法的注意事项值得我们重视

1.液相分离方法应用于蛋白纯化中内毒素的去除

a.目的蛋白上样后,用预冷的基础溶液+1% Triton X-114缓慢淋洗柱子,直至A280数值稳定不变;
b.用预冷的去内毒素基础溶液淋洗柱子,直至A280数值达到基线,稳定不变;
c.用各梯度去内毒素的洗脱液洗脱,收集各洗脱液于去内毒素的收集管中。
d.此方法适用广泛,如我们常用Ni柱、GST柱和离子交换柱等纯化。
e.纯化过程应尽量在洁净的环境下进行,纯化时间不宜过长。
f.所用的吸管、枪头等器材应为经去内毒素处理的。

2.液相分离法应用于大量样品中内毒素的去除

a.在大量蛋白样品中加入终浓度为 1% 的Triton X-114 ,充分混匀 ,冰浴 5min ,使之成为一相 ;
b.升温超过其浊点 21 ℃,37 ℃孵育 ,观察分层情况;
c.待溶液中出现明显分层后 ,室温下 12000r/min ,离心5min ,吸取上清液 ;
d.为达到较好的去除效果,可以重复 2 次。
e.如果样品内毒素含量较高,可以提高Triton X-114浓度至2%。
f.如果升温至37 ℃后,分层不明显或比较慢,可以升温至56 ℃孵育。
g.本方法不适用于去除膜蛋白中的内毒素

去内毒素试剂的配置

a.在溶解前将固体试剂用180 ℃烘4-5h,以去除试剂中的水分和内毒素。此法适用于试剂的熔点高于180 ℃ 。若试剂熔点低于180 ℃,常使用80 ℃烘过夜。

b. 去内毒素的水溶解烘过的试剂,定容,调节pH。

c.检测所配置试剂的内毒素含量是否达标,通常为0.01EU/ml。

常见的熔点低于180 ℃或高温分解的试剂:
1.Tris (168-172℃)2.尿素( 132.7℃ )3. 咪唑(89-91 ℃) 4.甘油( 17.8℃ )5.EDTA(150 ℃ 脱羟基)6.SDS(165 ℃ )7.肌氨酸钠( 120℃ )
常见的需烘烤后才加入的试剂:(危险品,挥发性气味)
1.DTT(42-43 ℃ )2.β-巯基乙醇(<-100 ℃ )